星形膠質細胞瘤中HSP70的表達及生物學活性

王曉東 陳善成 楊俊葆 李 衛 (暨南大學附屬第一醫院神經外科，廣東 廣州 510632)

手術治療膠質細胞瘤僅局限于減少腫瘤體積、降低腫瘤細胞數量，而手術后的化療、放療等綜合治療并未能顯著改善患者預后，部分惡性膠質細胞瘤患者術后的生存期不足1年〔1〕。探討與人腦星形膠質細胞瘤惡性程度相關的蛋白分子，明確其表達水平和生物學特性將為其診斷、預后和靶向治療提供依據。研究發現，熱休克蛋白(HSP70)在腫瘤免疫中具有重要作用〔2〕。本文分析HSP70與腦星形膠質細胞瘤病理分級的相關性，并探討其表達水平對患者預后的評估價值。

1 資料與方法

1.1 調查對象 收集某院2005年3月至2012年6月經病理切片明確診斷為腦星形膠質細胞瘤患者62例的臨床資料。按WHO(2000、2007年)中樞神經系統腫瘤分類標準確定病理診斷和分級〔3〕:Ⅰ級10例、Ⅱ級21例、Ⅲ級19例、Ⅳ級12例，其中男37例，女25例，平均年齡(37.26±14.51)歲。另選取同期住院的需手術切除正常腦組織的腦創傷患者5例(正常腦組織組)。

1.2 蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學染色 腦膠質細胞瘤組織行HE切片，光鏡下隨機選擇腫瘤細胞豐富、分布均勻區域計數存在于胞質內的陽性染色細胞個數進行組織學分析HSP70的表達、出血及片狀壞死區不作為觀察區域。

1.2.1 HE染色 二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色1～5 min，0.5%～1%鹽酸乙醇分化，1%氨水返藍，伊紅染色1～5 min，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。

1.2.2 免疫組織化學染色 石蠟切片脫蠟，梯度乙醇至水，3%H2O2去離子水孵育滅活內源性過氧化物酶，微波修復抗原10 min，山羊血清(1∶20)封閉非特異性抗原室溫下60 min，傾去多余血清，加1∶100稀釋的鼠抗人HSP70一抗于切片上，置濕盒內4℃過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次，滴加生物素化二抗工作液，加蓋濕盒內室溫下60 min，PBS沖洗5 min×3次，加入鏈霉素合素-生物素復合物(SABC)免疫組化試劑，室溫60 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色，顯微鏡下觀察，適時終止反應，蘇木素復染15～30 s和封片。陽性對照采用已知的膠質細胞瘤的陽性切片，以PBS代替一抗作為陰性對照。染色陽性表現為細胞膜。

1.3 觀察方法 由兩位長期從事免疫組化實驗的醫生通過雙盲法觀察切片，先在低倍鏡下觀察大體著色情況，400倍顯微鏡下隨機選取5個視野，每個高倍視野數取100個細胞，計數100個細胞中染色陽性細胞數，各組數值以±s表示。HE染色切片腦組織病理形態學改變，進行病理分級。染色強度根據陽性細胞的百分比進行定性分級:病灶的表達＜20%為陰性(－)，＞20%為陽性(+)，以定性分級結果比較HSP70表達與星形膠質細胞瘤臨床病理特點的關系。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0進行分析，采用非參數Kraskal-Wallis、Dunnet-t檢驗、χ2檢驗和應用生存分析。

2 結果

2.1 HSP70蛋白的分布與表達 HSP70陽性物質呈棕色顆粒狀，位于膠質細胞瘤的胞核和胞質中，以灶狀或顆粒點狀分布，不同病理分級HSP70免疫組化圖片，見圖1。HSP70在正常腦組織中呈基礎分布，HSP70計數值平均為5.60±1.82，各級星形膠質腫瘤細胞中HSP70分布呈逐級上升趨勢，經Spearman秩相關分析，腫瘤分級與HSP70分布呈正相關(r=0.685，P＜0.001)，具體分布情況，見表1。以正常腦組織為參照，腫瘤Ⅲ、Ⅳ級腦細胞中HSP70計數值分別為38.11±16.75、55.17±24.96，明顯高于正常腦組織(P＜0.01)。腫瘤Ⅰ、Ⅱ級HSP70計數值分別為15.2±7.58、24.38±14.40。

2.2 HSP70表達與星形膠質細胞瘤臨床病理特點的關系 62例星形膠質細胞瘤患者中，21例HSP70表達增高，與正常腦組織有差異(P＜0.05);HSP70表達情況與性別、年齡無關(P＞0.05);膠質瘤 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期中表達陽性率。見表1。

2.3 生存率比較 隨訪觀察患者5年生存率，HSP70陽性組5年生存率(36.1%)明顯低于HSP70陰性組(61.5%)(P=0.029)。生存曲線圖，見圖2。

圖1 不同病理分級HSP70免疫組化(DAB，×200)

表1 HSP70表達與星形膠質細胞瘤臨床病理特點的關系〔n(%)〕

圖2 HSP70陽性與陰性組生存曲線

3 討論

HSPs是機體應激反應性蛋白質，其作為一種“分子伴侶”參與細胞的生長、分化、基因轉錄，幫助胞內蛋白折疊、組裝和轉運，并具備免疫保護作用〔4〕。在HSPs的大家族中，HSP70為高度保守的ATP酶，在細胞應急或非應急狀態下蛋白質的代謝及調控中起重要作用，其表達水平的改變可以反映細胞老化狀態，還可以作為判斷細胞應激能力和生理狀態的指標。除了分子伴侶功能外，HSP70在腫瘤免疫中的重要作用近年來也備受關注。HSP70表達增強往往與腫瘤細胞的低分化、淋巴結轉移、腫瘤耐藥等密切相關，可能參與腫瘤細胞的某些生物活動;另一方面又能誘導和增強機體抗腫瘤免疫反應，抑制腫瘤生長。研究報道，HSP70參與了腫瘤細胞周期的調控和表型改變，腫瘤細胞的異質性使HSP70在與其相結合時成為腫瘤抗原多肽的靶載體，協助機體免疫系統對抗原肽識別，從而誘導特異性的抗腫瘤免疫反應〔5～7〕;HSP70能夠與腫瘤細胞內的腫瘤特異性抗原多肽結合形成復合物，通過與巨噬細胞、樹突細胞等抗原提呈細胞的表面受體特異的結合而激活特異性抗腫瘤免疫，而主要組織相容性復合體Ⅰ類分子如CD91、CD40、趨化因子、TLR4等參與介導途徑〔8〕。HSP70可通過調整 Th1/Th2調整機體免疫狀態或直接活化TCRγδT細胞或自然殺傷(NK)細胞參與非特異的抗腫瘤免疫作用〔9〕。

正常組織細胞中的HSP70僅有少量表達，并主要定位于細胞質中，但在腫瘤細胞中，HSP70可擴散出胞質外的胞核和胞膜中。HSP70在腫瘤細胞中的異常定位與腫瘤自身的增生和無限生長的腫瘤學特性相適應，反映了腫瘤細胞的生物學特性。目前已在多種腫瘤中發現HSP70的高表達〔5～7〕，在人腦膠質瘤細胞的系列蛋白表達譜分析鑒定中，HSP70被認為是高度惡性相關蛋白〔10〕。本研究結果說明HSP70與膠質瘤的分化程度有密切關系。文獻表明，HSP70作為“分子伴侶”可以調節和穩定腫瘤的異常增殖過程，介導錯配蛋白的降解，協調腫瘤細胞的蛋白質快速代謝平衡從而使腫瘤細胞無限增殖，同時HSP70與腫瘤組織產生的多肽結合，通過MHC-I將抗原提呈給T淋巴細胞，引發抗腫瘤免疫〔11〕;HSP70通過阻礙細胞色素C/dATP介導半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspases)的激活，阻斷功能性凋亡蛋白體的裝配抑制凋亡的發生來抑制凋亡〔12〕;

惡性腫瘤中HSP70高表達還與病人的帶瘤生存期呈現一定相關性〔13〕。HSP70可作為預測患者預后的一評價指標，同時也提示拮抗人腦膠質瘤中HSP70的合成，阻斷HSP70的抗凋亡作用可為膠質瘤的治療和改善膠質瘤的預后提供一種新的思路和方法。目前，多種涉及HSP70介導途徑的治療方法在其他類腫瘤中都有研究，如利用HSP70具備的免疫佐劑的特性通過腫瘤組織提取或基因工程生產HSP70抗原肽復合物，作為疫苗免疫機體，激發機體產生特異的抗腫瘤免疫的CTL效應〔14〕;利用HSP70分子伴侶作用，通過抗體阻斷〔15〕或反義脫氧寡核苷酸技術〔16〕抑制腫瘤細胞中高表達的HSP70，下調與腫瘤細胞惡性增生相關的基因產物的穩定性，達到提高腫瘤細胞放療、化療敏感性，進而遏制腫瘤細胞的增生，誘導其死亡。可以預見，隨著HSP分子生物學和免疫學機制的研究進一步了解，伴隨對人腦膠質瘤與HSP相關性的臨床研究進一步深入，提高人腦星形膠質細胞瘤患者的生存期可期。

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