IL-6基因-634位點G/C多態性與慢性心力衰竭的相關性

李克研 李美欣 張英杰 李今朝 屈寶澤 陳明紅 田 娟 李 寧

(遼寧醫學院附屬第一醫院心臟內科，遼寧 錦州 121000)

研究表明，炎癥反應是慢性心力衰竭(CHF)的發病機制之一〔1〕。白細胞介素6(IL-6)作為重要的炎癥因子，可直接或間接作用于CHF的發生和發展。IL-6基因多態性可影響其在血漿中的水平，近年來，關于IL-6基因多態性與疾病易感性的相關研究較多〔2，3〕。本研究應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)的方法，對遼寧地區漢族人群IL-6基因啟動子區域-634位點的多態性分布進行了研究，分析該多態性與CHF發病的相關性，以其從分子水平探討CHF發病的遺傳學機制。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇遼寧醫學院附屬第一醫院和錦州市中心醫院160例研究對象，年齡55～65歲，其中男85例，女75例，分為兩組，CHF組，男43例，女37例，健康對照組，男42例，女38例。CHF患者符合以下條件:①CHF診斷參照Framingham標準，心功能NYHA分級Ⅱ～Ⅳ級、超聲心動圖左室射血分數(LVEF)＜45%;② 年齡≥18歲;③CHF病史至少≥3個月。排除標準:①嚴重肝、腎功能不全;② 嚴重的急性感染或代謝紊亂;③急性心力衰竭。健康對照組受試者經體檢排除心血管疾病、嚴重肝腎疾病、甲狀腺疾病及糖尿病。

1.2 樣本采集和DNA提取 取各組受試者前臂靜脈血5 ml，注入裝有EDTA抗凝劑的試管中備用，應用小劑量基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取，具體步驟參照說明書進行。

1.3 IL-6-634 PCR擴增結果 PCR擴增引物序列為:正義鏈:5'-GAGACGCCTTGAAGTAACTG-3'，反義鏈:5'-AACCAAAGAT-GTTCTGAACTGA-3'(南京金斯瑞生物公司)。20 μl反應體系包括 10 × 緩沖液(Mg2+free)2 μl，dNTP1 μl(2 mmol/L)，MgCl2(25 mmol/L)1 μl，上、下游引物各 1 μl(4 μmol/L)，基因組DNA1 μl，Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，無菌去離子水補充至 20 μl。循環參數為預變性 94℃，5 min，94℃，30 s，60℃，50 s，72℃，1 min，共 35 個循環，最后延伸 72℃，10 min，4℃ 保存，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小為180 bp。

1.4 限制性內切酶酶切多態性分析 根據文獻〔4〕，限制性內切酶BsrB I酶切反應:取 PCR擴增產物5 μl，BsrB I內切酶2 U，10 × 酶切緩沖液 1 μl，無菌去離子水補足至總體積 10 μl，37℃水浴酶切過夜，酶切產物經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統直接讀取基因型結果。其中等位基因G由于存在BsrB I酶切位點而出現120 bp和60 bp 2個片段，等位基因C由于酶切位點消失而不能被切開，仍為180 bp 1個片段。因此結果有3種可能的基因型，即GG基因型為2條片段，分別為120 bp和60 bp，GC基因型為3條片段，分別為180 bp、120 bp和60 bp，CC基因型為1條片段，為180 bp。

1.5 統計分析 采用SPSS11.0軟件，計算各組的IL-6-634基因型及等位基因頻率，然后經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，率的比較采用χ2檢驗，將雜合子GC和純合子CC數據合并，再與純合子GG數據進行四格表資料比較，并以比值比(OR)及95%CI表示相對風險度。

2 結果

2.1 基因組DNA提取結果及PCR擴增結果 基因組DNA經試劑盒提取效果較好。基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統中觀察，目的片段大小為180 bp，見圖 1。

2.2 IL-6-634/BsrB I基因型判定結果 IL-6-634 PCR產物限制性核酸內切酶BrsB I酶切后，經3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果，判斷各受試者的基因型，見圖2，圖中1號樣本，180 bp、120 bp和60 bp 3條帶，基因型為 GC;2號樣本120 bp、60 bp 2條帶，基因型為GG。3號樣本僅有180 bp 1條帶，基因型為CC。

2.3 CHF組及健康組IL-6-634/BsrB I等位基因及基因型頻率分布與比較 CHF組和健康對照組基因型均以CC型為主，GC型次之，GG型最少;等位基因以C為主。IL-6-634基因型兩組差異顯著(χ2=4.738，P＜0.05);等位基因頻率分布在兩組之間也存在顯著差異(χ2=5.391，P＜0.05)。見表1。

圖1 IL-6-634 PCR擴增結果

圖2 IL-6-634基因分型結果

表1 IL-6-634/BsrB I的基因型頻率及等位基因頻率〔n(%)，n=80〕

3 討論

IL-6主要由活化的單核巨噬細胞所產生，產生后促進肝細胞生成急性期反應蛋白——C反應蛋白(CRP)，普遍認為CRP是冠心病發病危險因素之一。IL-6作為炎癥細胞分化的主要調節因子，可促進巨噬細胞分化、浸潤，并調節其他黏附分子和細胞因子的表達，從而加強炎癥反應;同時IL-6尚可促進心肌細胞表達黏附分子，增強中性粒細胞和心肌細胞的黏附作用，促進中性粒細胞釋放氧自由基，從而加重心肌細胞的損傷。IL-6水平升高與冠心病的發展及嚴重程度密切相關〔5，6〕。Georges等〔7〕的研究也證實了此結論。本研究結果提示IL-6-634 G/C多態性與CHF的發病具有一定的相關性，等位基因G可能是CHF發病的易感基因，其具體機制有待進一步研究。

1 Biasucci LM，Santamaria M，Liuzzo G.Inflammation，atherosclerosis and acute coronary syndromes〔J〕.Minerva Cardioangiol，2002;50(5):475-86.

2 Zhang HY.The association of IL-6 and IL-6R gene polymorphisms with chronic periodontitis in a Chinese population〔J〕.Oral Dis，2014;20(1):69-75.

3 Kosugi EM.Interleukin-6-174 G/C promoter gene polymorphism in nasal polyposis and asthma〔J〕.Rhinology，2013;51(1):70-6.

4 何美霞，張明明，劉 瓊，等.白細胞介素-6基因多態性與高脂血癥的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(1):23-5.

5 Weissberg PL，Bennett MR.Atherosclerosis-an inflammatory disease〔J〕.N Engl J Med，1999;340(24):1928-9.

6 Gabriel AS，Ahnve S，Wretlind B.IL-6 and IL-1 receptor antagonist in stable angina pectoris and relation of IL-6 to clinical findings in acutemyocardial infarction〔J〕.J Intern Med，2000;248(1):61-6.

7 Georges JL，Loukaci V，Poirier O，et al.Interleukin-6 gene polymorphisms and susceptibility to myocardial infarction:the ECTIM study.Etude Cas-Temoin de I'Infarctus du Myocarde〔J〕.J Mol Med，2001;79(5-6):300-5.