載脂蛋白Eε4基因型預測老年缺血性腦血管病復發的意義

李國輝 (梧州市紅十字會醫院神經內科，廣西 梧州 543002)

缺血性腦血管病(ICVD)已經成為引起老年死亡和癱瘓的最主要原因之一〔1〕，傳統的危險因素如高血壓、糖尿病，吸煙，高膽固醇血癥以及心臟病等均與缺血性腦血管病的發病率和復發有關。但最新的研究認為ICVD病情復雜，病因多，不僅受傳統的危險因素的影響，還受遺傳因素的影響〔2〕。基因可以直接影響腦卒中的發生血管危險因素和動脈粥樣硬化的發生發展。已有文獻表明〔3〕，在心肌梗死的患者中存在幾個潛在的基因多態性，但這些基因多態性是否與腦卒中有關目前尚未見報道。載脂蛋白E(APOE)的基因多態性是影響血漿脂蛋白的重要調節因素，也是阿爾茨海默病(AD)的一個危險因素。載脂蛋白E基因位于19號染色體上，常見有3種多態性E2，E3和E4，分別編碼血漿中的載脂蛋白E(apoE)異構體。載脂蛋白E影響肝臟對脂蛋白的結合、吸收和分解代謝，并與血清脂蛋白水平相關。研究證明〔4〕APOE基因多態性與動脈粥樣硬化有明顯的關系。臨床研究表明〔5〕，APOEε4等位基因與中國人群的心肌梗死和冠狀動脈粥樣硬化的發生也有密切的聯系，但它與ICVD的關系至今尚未有定論，結果也多是相互矛盾的。國外有人認為〔6〕，APOEε2與 ICVD 有關，載脂蛋白 Eε4不僅與ICVD有關，還與粥樣硬化的發生有關，但也有人認為APO的基因型與腦梗死沒有明顯的相關性。為探討APOEε4單體型對動脈粥樣硬化的影響及其在誘發動脈粥樣硬化中的可能性作用，本研究評估了APOEε4單體型與ICVD復發的關系，旨在尋找一個可以用來預測中國人群發生ICVD的特定的APOE基因單體型。

1 對象與方法

1.1 實驗對象 2010年6月至2012年12月在梧州市紅十字會醫院神經內科診斷并接受治療的ICVD患者248例，在隨訪結束時幸存者215例，其中男121例，女94例，年齡43～87歲〔平均(64.73±13.21)〕歲。所有患者均接受神經內科醫師對其進行常規臨床評估，包括病史詢問和體格檢查，同時還進行了實驗室檢查、胸片、超聲心電圖和磁共振成像(MRI)檢查。排除疑似老年癡呆癥(即在發生ICVD之前，記憶、語言和其他認知功能已逐步下降)和有出血性腦卒中病史的患者。本研究在醫院倫理委員會的同意下進行。

1.2 ICVD的診斷標準及分類 當患者出現漸進性的或偶爾快速發展的神經系統癥狀持續24 h以上，并經CT或MRI檢測到的相應的腦缺血性改變，可診斷為ICVD。其中明顯的腦卒中或短暫性腦缺血發作患者排除在外。根據磁共振血管造影(MRA)、常規血管造影、頸動脈多普勒超聲檢查、心電圖和超聲心動圖結果確認腦卒中的亞型。

1.3 腦卒中危險因素評估 臨床資料包括年齡、性別、高血壓史(即入院前已服用降壓藥，或在出現缺血性腦血管病指征1個月內多次測量血壓，均為收縮壓＞160 mmHg或舒張壓＞95 mmHg)，糖尿病(即空腹血糖水平＞140 mg/dl或有糖尿病治療史)，高脂血癥(即在入選時的總膽固醇水平＞220 mg/dl，甘油三酯水平＞150 mg/dl，或高密度脂蛋白＜40 mg/dl，或有高脂血癥治療史)，吸煙習慣(分為當前吸煙者，戒煙者，或不吸煙)，ICVD家族史或ICVD前兆(即在ICVD指征出現前已出現的可通過神經影像學證明其存在的臨床癥狀)和心臟病(已知心臟病史或有心臟病臨床指征，包括心肌梗死、心絞痛、充血性心臟衰竭或心律不齊等)。

1.4 隨訪 患者治療出院后每3個月復查1次，隨訪時間至2013年6月。詢問患者和(或)護理人員是否有出現腦卒中癥狀或其他新的神經癥狀。通過審查相關的醫療記錄和神經影像學資料(CT或MRI結果)確認患者是否復發ICVD。在隨訪期間，有33例患者病故或失訪，故這些患者最后也被排除在外。其余215例存活病人繼續接受體檢，并根據腦卒中亞型進行藥物治療，以預防ICVD復發。

1.5 APOE基因分型 APOE基因分型采用PCR－RFLP法進行。受試者常規禁食12 h后，于次日6:00～7:00采外周靜脈血4 ml，采用檸檬酸鈉抗凝，利用常規酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。APOE基因特異性引物采用文獻報道〔7〕中現成的序列，上游為 5’－TCC AAG GAG CTG CAG GCG GCG CA－3’，下游為 5’－ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC ACT GCC A3’。PCR擴增條件:94℃預變性 5 min，65℃退火 30 s，70℃延伸90 s，40個循環，再繼續70℃延伸10 min。PCR產物長度為227 bp，涵蓋APOE所有的多態性位點。取20 μl PCR產物，加入對APOEε4基因特異的HhaI內切酶10 U，在37℃進行限制性酶切反應5 h。酶切產物在15%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳5 h，恒流60 mA。電泳完畢，凝膠經EB染色后于ChampGel 3200圖像采集系統(北京賽智創業科技有限公司)中進行掃描分析。

1.6 統計學分析 應用SPSS13.0軟件。采用Kaplan－Meier乘積極限法估計各組中ICVD復發的累積比例，多變量分析采用COX危險比分析法。計數資料組間對比采用χ2檢驗，計量資料組間比較采用兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1 患者臨床資料比較 本研究215例ICVD存活者中有APOEε4基因陽性者38例(17.7%)。以 APOEε4基因進行分組，可分為APOEε4基因陽性組和APOEε4基因陰性組〔177例(82.3%)〕。對兩組患者的臨床資料進行比較時發現，APOEε4基因陽性組患者出現腦卒中前兆的比例為78.9%，明顯高于APOEε4基因陰性組患者(35.0%，P＜0.01)，而其他臨床資料，包括年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙習慣、腦卒中家族史及心臟病等，在兩組間則不存在顯著差異(見表1)。

表1 ICVD患者的臨床資料〔n(%)〕

2.2 腦卒中亞型在APOEε4基因陽性或陰性組中的分布 分別對兩組患者的腦卒中亞型進行分類，腦卒中亞型在APOEε4基因陽性或陰性組中的分布無顯著差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 APOEε4單體型與ICVD復發的關系 在隨訪期間，有48例患者癥狀復發，采用Kaplan－Meier法估算出3年的累積復發率為22.3%。通過COX危險比回歸模型分析ICVD的預后因素，結果發現，心臟病是ICVD復發的一個危險因素(危險比3.04，95%CI=1.23～7.51，P=0.2)，ICVD 前兆對 ICVD 是否復發有影響，但不具有統計學意義(危險比1.59，95%CI=0.58～4.31，P=0.6)。APOEε4基因也是ICVD復發風險的一個重要的預測因子(危險比為 4.11，95%CI:1.49～11.32，P＜0.001)。38例攜帶APOEε4基因單體型的ICVD患者中有20例復發，發生率為52.6%，而177例不攜帶APOEε4基因單體型的ICVD患者中有28例復發，其發生率僅為15.8%。

表2 腦卒中亞型在APOEε4基因陽性或陰性組中的分布〔n(%)〕

3 討論

ε4等位基因在冠狀動脈心臟疾病和ICVD中的作用機制目前尚不清楚。有學者認為〔8〕，APOE基因多態性會導致脂蛋白代謝發生異常，而ε4等位基因可能會導致低密度脂蛋白的產量增加及其在外周血中的分解代謝降低。APOE基因在動脈粥樣硬化形成過程中的作用已被多個研究證明，如Cao等〔9〕發現，APOE缺陷小鼠會發生血脂異常及動脈粥樣硬化性病變，而將APOE基因導入到APOE缺陷小鼠中，則會使血脂水平恢復正常，飲食誘導的動脈粥樣硬化也會得到緩解，已存在的斑塊會逐漸減小。但是，APOEε4等位基因與冠心病的關系在調整了低密度脂蛋白膽固醇水平之后仍然會存在，而這種現象同樣存在于頸動脈粥樣硬化中，由此表明，APOEε4等位基因與脂蛋白水平并沒有直接的聯系。APOE等位基因特異的抗氧化活性可能是由 ε4等位基因引起的。另有研究發現〔10，11〕，將人的APOEε3和ε4基因分別導入到APOE缺失的裸鼠體內，ε4轉基因小鼠比ε3轉基因小鼠更容易發生大腦損傷，原因可能是APOEε3基因具有保護性作用，而ε4基因則起到致病性作用。

近年來，人們逐漸發現APOEε4基因多態性與中國漢族人群中的阿爾茨海默氏病患者的認知障礙有密切的聯系〔12～14〕，但其與復發型ICVD的關系尚未見有研究報道。本研究經多因素分析結果發現，除心臟病是ICVD復發的一個危險因素之外，APOEε4基因也是ICVD復發的一個重要風險因素。以前的研究結果表明〔15〕，傳統的心血管危險因素，如男性、吸煙、高血壓、糖尿病及高脂血癥等均能預測心血管疾病和腦血管疾病，但在本研究中，這些因素與ICVD復發并無顯著關系，這可能與樣本量太小有關。本研究主要探討APOEε4基因與ICVD復發的關系而不是與ICVD發病的關系，所以本組研究對象未包含正常人群。因為已有的研究證明，ICVD患者中的APOEε4基因陽性率與正常人群之間差異并不明顯〔7〕。

本研究發現APOEε4基因型與ICVD的復發有明顯的相關性，可以作為一個評估ICVD患者預后尤其是復發風險的一個預測因素。同時，本研究結果還可以用于篩查具有高危復發風險的ICVD患者，通過及早采取適當的預防措施有效避免ICVD的復發。

1 Percy M，Somerville MJ，Hicks M，et al.Risk factors for development of dementia in a unique six－year cohort study.I.An exploratory，pilot study of involvement of the E4 allele of Apolipoprotein E，mutations of the hemochromatosis－HFE gene，type 2 diabetes，and stroke〔J〕.J Alzheimers Dis，2014;38(4):907－22.

2 Hooshmand B，Polvikoski T，Kivipelto M，et al.Plasma homocysteine，Alzheimer and cerebrovascular pathology:a population－based autopsy study〔J〕.Brain，2013;136(Pt 9):2707－16.

3 Schilling S，DeStefano AL，Sachdev PS，et al.APOE genotype and MRI markers of cerebrovascular disease:systematic review and meta－analysis〔J〕.Neurology，2013;81(3):292－300.

4 Liu HW，Zhang F，Fan P，et al.Effects of apolipoprotein E genotypes on metabolic profile and oxidative stress in South－West Chinese women with polycystic ovary syndrome〔J〕.Eur J Obstet Gynecol Reprot Biol，2013;170(1):146－51.

5 Ayata C，Shin HK，Dilek?z E，et al.Hyperlipidemia disrupts cerebrovascular reflexes and worsens ischemic perfusion defect〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2013;33(6):954－62.

6 Zlokovic BV.Cerebrovascular effects of apolipoprotein E:implications for Alzheimer disease〔J〕.JAMA Neurol，2013;70(4):440－4.

7 Cerrato P，Baima C，Grasso M，et al.Apolipoprotein E polymorphism and stroke subtypes in an Italian cohort〔J〕.Cerebrovasc Dis，2005;20(4):264－9.

8 Wierenga CE，Clark LR，Dev SI，et al.Interaction of age and APOE genotype on cerebral blood flow at rest〔J〕.J Alzheimers Dis，2013;34(4):921－35.

9 Cao L，Wang K，Gu T，et al.Association between APOE epsilon 4 allele and postoperative cognitive dysfunction:A meta－analysis〔J〕.Int J Neurosci，2013;124(7):478－85.

10 王景濤，李 凌，袁 晶，等.載脂蛋白E基因與中國漢族阿爾茨海默病發病年齡的相關性〔J〕.中華醫學雜志，2013;93(3):182－6.

11 Yin YW，Sun QQ，Zhang BB，et al.Association between apolipoprotein E gene polymorphism and the risk of coronary artery disease in Chinese population:evidence from a meta－analysis of 40 studies〔J〕.PLoS One，2013;8(6):e66924.

12 Bell RD，Winkler EA，Singh I，et al.Apolipoprotein E controls cerebrovascular integrity via cyclophilin A〔J〕.Nature，2012;485(7399):512－6.

13 Ruzali WA，Kehoe PG，Love S.Influence of LRP－1 and apolipoprotein E on amyloid－β uptake and toxicity to cerebrovascular smooth muscle cells〔J〕.J Alzheimers Dis，2013;33(1):95－110.

14 Zhang Z，Mu J，Li J，et al.Aberrant apolipoprotein E expression and cognitive dysfunction in patients with poststroke depression〔J〕.Genet Test Mol Biomarkers，2013;17(1):47－51.

15 Frikke－Schmidt R，Nordestgaard BG，Thudium D，et al.APOE genotype predicts AD and other dementia but not ischemic cerebrovascular disease〔J〕.Neurology，2001;56(2):194－200.