丁苯酞對戊四氮致癇大鼠癲癇發作及海馬內5-羥色胺及硫化氫含量的影響

安 娜 姜洪波 徐 磊 董獻紅 張瑞嶺 杜愛林

(新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室，河南 新鄉 453003)

丁苯酞(NBP)是我國成功研制出的具有自主知識產權的一類化學新藥，是從芹菜種子中分離出的有效成分，據報道，NBP有抗驚厥、抗癲癇作用〔1〕。5-羥色胺(HT)是中樞神經系統中重要的單胺類遞質，參與人類的行為、情緒等眾多生理過程的調節。以往研究認為5-HT是一種抑制性遞質，對癲癇的形成具有抑制作用〔2〕，某些類型的癲癇與大腦的5-HT能系統功能異常有關〔3〕。但目前對內源性5-HT在癲癇形成過程的作用研究相對較少，也尚未有作用于5-HT能系統的藥物應用于臨床。硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的毒性氣體，以往的研究多集中在其毒性作用，但目前越來越多的證據表明，內源性H2S在循環系統、神經系統、呼吸系統、心血管系統等均有重要生理作用，并參與了一些疾病的病理生理過程，成為繼NO和CO之后新發現的第三類氣體信號分子〔4〕。且已有研究證實外源性H2S可改善癲癇大鼠腦認知功能障礙，內源性H2S在熱性驚覺的發病機制中發揮著重要作用〔5〕，但這些研究均需進一步驗證。本研究通過建立大鼠戊四氮(PTZ)慢性點燃模型，觀察NBP對其海馬內5-HT含量的影響及海馬內H2S的變化，研究NBP抗癲癇作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性成年SD大鼠40只，質量(350±20)g，由實驗動物中心提供，隨機分為正常對照組(NC組)，丁苯酞低劑量組(NL組)、丁苯酞中劑量組(NM組)、丁苯酞高劑量組(NH組)、PTZ組(P組)，每組8只，除NC組以外均建立PTZ慢性點燃癲癇模型。

1.1.2 儀器與試劑 Bio-Tek ELx800酶標儀由美國Bio-Tek公司生產;超低溫冰箱由美國Thermo Forma公司提供;高速冷凍離心機由德國Heraeus公司生產;Eclipse E200顯微鏡由日本Nikon公司提供;戊四氮由生產;NaHS由美國ACROS公司提供;5-羥色胺系北京博奧森有限公司生產;硫化氫測定試劑由鄭州九是公司提供;SP檢測試劑盒與DAB試劑盒系中杉金橋公司生產。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 NBP各劑量組和PTZ組大鼠均給予腹腔注射 PTZ 35 mg·kg－1·d－1。NBP 各劑量組分別給予 10、20、40 mg/kg劑量的NBP灌胃。按照Racine標準判定癲癇發作的程度〔6〕。0級:無驚厥;1級:咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐;2級:單側前肢的陣攣、抽搐;3級:以點頭運動為主的頸部肌肉抽搐;4級:雙側前肢的陣攣、抽搐伴身體立起;5級:雙側后肢強直、身體背曲強直、跌倒。連續3次達到5級的大鼠即認為模型制作成功。各組驚厥發作的潛伏期(從給藥開始計時，到首次發作的時間)、發作次數和強度以分級量表進行模型評價。每次給藥后觀察30 min，凡連續3次出現5級發作即判定該鼠被慢性點燃。

1.2.2 組織取材 各組大鼠麻醉后，立即斷頭，迅速取出腦組織，每只大鼠取一側海馬用4%多聚甲醛固定，常規制作石蠟切片，用于免疫組化。另取剩下一側海馬存放于－70℃冰箱中，用于組織中H2S含量檢測。

1.2.3 指標檢測 分光光度法間接測定海馬組織H2S的含量〔7〕，用全自動酶標儀在波長670 nm處測定吸光度，根據H2S標準曲線計算溶液中的H2S含量，海馬中H2S含量以單位重量的組織H2S的量(nmol/g)表示。

1.2.4 免疫組化 石蠟切片經脫蠟復水后，進行免疫組化，DAB顯色，常規脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察并攝片。在高倍顯微鏡(400×)下每張切片隨機攝取雙側海馬CA1區各4個視野圖片，用image-pro-plus 6.0圖像處理軟件對5-HT的陽性表達情況進行分析，取其平均值作為判斷5-HT陽性的表達情況。

2 結果

2.1 癲癇大鼠海馬內H2S含量 NH組(0.358 6±0.005 14)與NC照(0.347 8±0.007 15)組相比，海馬內H2S升高(P＜0.01);NM組(0.349 6±0.005 83)與NC組比較，海馬內H2S升高，但差異無顯著性(P＞0.05)。

2.2 不同組PTZ點燃大鼠慢性癲癇模型的評價參數 與P組比較NL組癲癇發作的潛伏期、模型制作成功的時間無顯著差異。NM、NH組大鼠癲癇發作的潛伏期顯著延長(P＜0.01，P＜0.05)，模型制作成功的時間明顯延長(P＜0.05，P＜0.05)。見表1。

2.3 光鏡觀察 NC組大鼠海馬CA1區可見一定量的5-HT受體陽性表達，陽性反應細胞著色深。各組與NC組(0.972 3±0.026 8)相比，5-HT受體陽性表達量明顯降低(P＜0.01)。NM組(0.915 6±0.022 2)5-HT受體陽性表達量最接近NC組，與P組(0.584 9±0.039 6)比較有極顯著性差異(P＜0.01)。NH組(0.790 6±0.107)與P組比較，5-HT受體陽性表達明顯升高(P＜0.01)。P組和NL組(0.829 9±0.142)海馬內5-HT水平比較。差異顯著(P＜0.05)。P組海馬內5-HT水平顯著低于NC組和NM、NH組(均P＜0.01)。NM、NH組海馬內5-HT水平比較差異有統計學意義(P＜0.05)。光鏡下海馬細胞的變化見圖1。

表1 不同組PTZ點燃大鼠慢性癲癇模型的評價參數(±s，n=8)

表1 不同組PTZ點燃大鼠慢性癲癇模型的評價參數(±s，n=8)

與P組比較:1)P＜0.05;與NC組比較:2)P＜0.05;“－”表示不誘發

組別 潛伏期(s)7 d 10 d 14 d第1次達到V級的時間(d) 點燃時間19 d點燃率(%)死亡率(%)NC組 － － － － － －－100.0 0 P組 38.5±11.9 31.0±5.29 29.8±7.50 2 13.14±2.48 87.5 12.5 NL組 42.7±28.6 49.7±17.1 29.8±13.1 2 12.75±1.16 100.0 0 NM組 58.5±37.3 58.5±23.11) 53.7±28.91) 5 16.63±2.442) 100.0 0 NH組 60.5±27.8 47.5±24.4 60.7±25.21) 7 15.88±2.652)

圖1 各組大鼠海馬CA1區光鏡下(×400)

3 討論

NBP是我國于2004年11月批準上市的國家一類新藥，為人工合成的消旋體，其左旋體存在于芹菜籽中。NBP發揮神經保護作用靶點比較廣泛，可作用于腦缺血病理的多個環節，同時還具有促進腦血管生成〔8〕、改善記憶障礙、對腦損傷的保護作用和抗驚厥等作用，不良反應比較小〔9〕。

選擇適當而有價值的動物模型是有效研究癲癇發病機制及其治療藥物的重要手段〔10〕，PTZ點燃癲癇發作模型能很好地模擬人類癲癇，癲癇發作可短期或長期作用于動物的行為和腦神經遞質的活性。一次大劑量PTZ腹腔注射可引起較大強度的癲癇發作，但大鼠并不發展為慢性癲癇，只有在長期反復閾下劑量導致較長時間的發作后，動物轉向具有人類性質的慢性EP，這一過程稱為慢性點燃〔11〕。

有研究顯示，提高細胞外5-HT水平的物質，如5-色氨酸和5-HT再攝取抑制劑，可以抑制局灶性、邊緣性和全面性發作〔12〕;耗竭腦內5-HT水平會降低對聽源性、化學性和電刺激誘發抽搐的發作閾值〔13〕。已有許多證據顯示5-HT具有抑制各種癲癇模型全面性驚厥發作和減輕癲癇患者發作的作用〔12〕。增加腦內5-HT濃度可以減少最大電休克誘發發作的嚴重程度，耗竭5-HT會增加誘導的強直發作的發生率〔14〕。本研究提示NBP改善癲癇發作的機制之一可能為升高海馬內5-HT含量，保護海馬神經元。

H2S是近年來發現的新型氣體信號分子，可作為一種重要的神經遞質，對中樞神經系統功能有著重要的調節和保護作用，參與了一些神經系統疾病的發生發展過程〔15，16〕。韓曉偉〔17〕的研究表明外源性H2S供體NaHS提高癲癇大鼠H2S/CBS表達水平后，可一定程度延長大鼠癲癇發作的潛伏期和減少大鼠自發性癲癇的發作次數，提示H2S/CBS與癲癇的發病存在相互關系。鐘聰敏〔18〕進一步闡述了生理濃度的 H2S可以激活海馬CA1區的Cl-通道及γ-氨基丁酸(GABA)A受體介導的Cl-電流來降低L-谷氨酸引起的神經元興奮作用，并且H2S以劑量依賴的方式保護細胞免受谷氨酸的氧化毒性作用。PTZ是氯離子通道的非競爭性抑制劑，與GABAA受體結合，通過異構作用于Cl-通道，阻滯了GABA受體介導的Cl-內流，引起神經細胞膜去極化、擴散和維持癲癇發作。由以上可知生理濃度H2S的抗癲癇機制是一定程度上對抗了PTZ的作用。本研究提示NBP可能通過升高大鼠海馬內H2S來發揮抗癲癇的作用。

綜上所述，本研究提示NBP除了用于腦缺血的治療〔8〕外對癲癇還有一定的效果，其抗癲癇的可能機制為升高了海馬內5-HT和H2S的含量。但由于本研究是小樣本實驗，準確的抗癲癇機制還需進一步研究。

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4 Wang R.Two's company，three's a crowd:can H2S be the third endogenous gaseous transmitter〔J〕?FASEB J，2002;16:1792-8.

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6 譚文瀾，張永全，陸 暉，等.抗癇煎劑對戊四氮誘導小鼠癲癇模型的影響〔J〕.西部中醫藥，2011;24(11):18-9.

7 黃琬璐，杜愛林，姜洪波，等.全腦缺血再灌注大鼠血液內源性H2S的動態變化〔J〕.河南職工醫學院學報，2010;22(5):521-3.

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16 WANG R.Two's company，three's a crowd:can H2S be the third endogenous gaseous transmitter〔J〕?FASEB J，2002;16:1792-8.

17 韓曉偉.癲癇大鼠腦中H2S/CBS體系的變化及作用〔D〕.遵義:遵義醫學院，2011.

18 鐘聰敏.硫化氫對大鼠海馬CA1區神經元放電活動及谷氨酸興奮性損傷的作用〔D〕.石家莊:河北醫科大學，2011.