mir-134/Pum2信號通路在匹羅卡品致顛癇大鼠腦組織中的表達及作用

吳旭玲 陳陽美 (重慶醫科大學附屬第二醫院神經內科，重慶 400010)

研究顯示難治性癲癇的發生與腦內神經元形成的異常網絡連接緊密相關〔1〕，而神經元樹突和軸突的異常芽生會導致突觸重組使神經元之間形成異常的興奮性網絡連接〔2〕。已經有研究顯示多種miRNA與癲癇的發病機制相關〔3〕，其中mir-134可以調控樹突棘的形態參與癲癇的發生〔4〕，而Pumilio2(Pum2)的下調則是mir-134促進樹突生長的必要環節〔5〕。有研究表明Pum2與神經元樹突的生長和分支有關，在突觸重組中發揮重要作用〔6〕;另外，Pum2還可以在翻譯水平調控電壓門控鈉離子通道(Nav)的表達，參與神經元興奮性的調節〔7〕。這些都提示Pum2可能與癲癇的發生存在著某種關系。本研究擬驗證mir-134和Pum2在癲癇大鼠模型中的表達情況并對Pum2的表達進行定位。

1 材料與方法

1.1 癲癇模型建立 所有動物實驗程序符合國際倫理準則，并得到了重慶醫科大學倫理委員會的同意。選取體重180～220 g的成年雄性S-D大鼠42只，均來自于重慶醫科大學實驗動物中心，飼養在標準環境條件下(溫度:20℃，濕度:50%～60%)，大鼠被隨機分為7組，分別為生理鹽水對照組大鼠、癲癇大發作后 1、3、7、14、30、60 d 大鼠。腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg，美國 Sigma公司)18～24 h后給予匹羅卡品(35 mg/kg，美國Sigma公司)腹腔注射，應用匹羅卡品前30 min腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg以減輕匹羅卡品的外周膽堿能效應。30 min后若無 Racine分級〔8〕Ⅳ級以上發作，則每隔10 min追加一次匹羅卡品(10 mg/kg)，直到達到以上級別，每只大鼠的追加總量不超過50 mg/kg，達到Ⅳ級以上發作的大鼠在癲癇持續狀態1 h后給予地西泮10 mg/kg終止發作。

1.2 組織處理 10%水合氯醛3 ml/kg充分麻醉大鼠，斷頭后取出大腦，迅速剝離出海馬組織放于液氮中，隨后儲存于－80℃，用于蛋白和RNA的提取。剩余部分大鼠在麻醉后用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注，隨后取出大腦固定于4%多聚甲醛中24 h，切成10 μm厚的冰凍切片用于免疫熒光檢測。

1.3 熒光定量PCR 用RNAiso plus試劑(TaKaRa公司)提取大鼠腦組織中的總RNA，提取流程按操作說明書進行，提取好的總RNA的濃度和純度用波長260/280 nm檢測，當A260/A280比值1.8～2.2時RNA可用于逆轉錄反應。用TaKaRa的逆轉錄試劑盒根據其說明步驟得到互補的cDNA，擴增反應在Bio-Rad CFX96實時PCR檢測系統中進行，用u6小RNA作為內參。PCR反應體系包括:去離子水3.2 μl，SYRB Green熒光染料(TaKaRa 公司)5 μl，上下游引物各 0.4 μl和 cDNA 1 μl。反應條件為:①95℃，30 s;②95℃，5 s;③60℃，30 s;④第2～3步循環39次，⑤65℃升至95℃行溶解曲線分析(升溫速率0.5℃ /次，5 s)。

1.4 蛋白免疫印跡檢測 用總蛋白提取試劑盒(凱基)提取大鼠腦組織中的蛋白，用增強BCA試劑(碧云天)測定蛋白濃度。從蛋白樣品中取50 μg總蛋白于8%SDS-PAGE上電泳，并電轉到PVDF膜上。在室溫條件下用5%BSA孵育PVDF纖維膜1.5 h，然后用兔多克隆一抗 Pum2(1∶5 000，GeneTex)和 β-actin(1∶1 000，Santa Cruz)孵育PVDF膜4℃過夜;次日，室溫下孵育PVDF膜于辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000，杉金橋)中2 h。最后在暗室中用ECL試劑(Pierce公司)對蛋白條帶進行顯影。用Quantity One 4.6.2軟件分析Pum2的相對含量，β-actin作為內參。

1.5 雙標免疫熒光 冰凍切片于室溫下自然晾干后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，將切片浸泡于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)在微波爐中高火煮沸5 min再調至低火15 min，隨后取出于室溫下自然冷卻。0.04%Triton X-100(Sigma)37℃孵育15 min后再用正常山羊血清(中杉金橋)37℃封閉30 min，甩掉多余血清，滴加配好的混合一抗4℃過夜。混合一抗為兔抗大鼠Pum2抗體(1∶50，GeneTex)分別與以下三種物質的混合:小鼠抗大鼠MAP2抗體(1∶50，Abcam)、小鼠抗大鼠GFAP 抗體(1∶300，CST)和碘化丙啶(100 μg/ml，Sigma)。第二天，37℃復溫1 h后充分沖洗一抗，滴加FITC標記的山羊抗兔二抗(1∶100，中杉金橋)和TRITC標記的山羊抗小鼠二抗(1∶100，中杉金橋)混合抗體于37℃下避光孵育1 h，最后充分沖洗二抗用50%甘油封片。

1.6 圖像采集和統計學分析 用激光掃描共聚焦顯微鏡對雙標免疫熒光結果進行圖像采集。數據用±s表示，采用SPSS 20.0軟件行LSD檢驗。

2 結果

2.1 mir-134在大鼠癲癇模型中各時間點的表達變化 與對照組(0.53±0.06)大鼠相比，癲癇大發作后mir-134的表達變化有波動性:急性期(1 d和3 d)的大鼠mir-134表達(1.13±0.17、1.70±0.14)顯著升高(P＜0.05);在隨后的潛伏期(7 d和14 d)mir-134水平(0.66±0.08、0.73±0.12)有所下降，但仍高于對照組，差異無統計學意義(P＞0.05);慢性期(30 d和60 d)，mir-134的表達(0.157±0.16、1.67±0.10)又明顯上調(P＜0.05)且居于一個相對穩定的水平。

2.2 Pum2蛋白在癲癇大鼠海馬及鄰近皮質中的表達變化情況 在點燃后的急性期1 d(0.47±0.13)和3 d(0.47±0.09)，Pum2的表達水平就明顯低于對照組(0.78±0.12)(P＜0.05)，第7天(0.56±0.08)Pum2的表達水平較急性期有所升高，但仍顯著低于對照組(P＜0.05);在隨后的14 d(0.43±0.13)、30 d(0.30±0.07)和60 d(0.28±0.03)，Pum2的表達又趨于下降，均低于對照組(P＜0.05)，在慢性期達到最低水平。見圖1。

圖1 各組Pum2的蛋白免疫印跡結果

2.3 雙標免疫熒光 用雙標免疫熒光對Pum2蛋白的表達進行定位，Pum2(綠色信號)與神經元標志物MAP2(紅色信號)的表達位置重合，而與星形膠質細胞標志物GFAP(紅色信號)和細胞核標記物PI(紅色信號)均不重合，見圖2，說明Pum2在腦內表達于神經元細胞質和樹突中。

圖2 雙標免疫熒光檢測Pum2在細胞中的定位

3 討論

腦內廣泛性興奮性環路的形成是癲癇形成的主要神經病理學改變，異常的樹突生長和突觸重組會導致神經元之間的異常聯系促進神經環路的建立。Fiore等〔5〕已經在體外實驗中證明活性依賴的mir-134可以通過對Pum2的調控促進樹突的生長。但mir-134/Pum2信號通路是否參與了癲癇的發病機制還不夠明確，介于氯化鋰-匹羅卡品模型是研究人類顳葉難治性癲癇病理生理機制極具代表性的工具〔9〕，所以本實驗在匹羅卡品癲癇大鼠模型中對mir-134和Pum2的表達進行了研究。

miRNA在翻譯水平對蛋白合成進行調控，研究顯示腦內某些miRNA與突觸重組緊密相關。樹突棘是存在于樹突表明的細小突起，為主要的興奮性突觸的突出后成分，其動態變化是突觸重組的重要形式。mir-134是一種腦特異性的miRNA，表達于神經元樹突上并能負性調控樹突棘的大小〔10〕。這一作用是通過抑制LIM區域激酶(Limk)1的mRNA翻譯介導的，Limk1可以磷酸化絲切蛋白(cofilin)并使其失去剪切活性從而改變神經元突起的形態。Jimenez-Mateos等〔11〕發現沉默mir-134可以使小鼠海馬CA3區樹突棘密度降低，并且具有神經保護功能，有效抑制癲癇的發作。本研究用熒光定量 PCR測定癲癇大鼠海馬內的mir-134表達變化，發現在點燃后的急性期mir-134就有顯著升高，潛伏期降至接近正常水平，當進行到自發性癲癇的慢性期時mir-134的表達又回升到一個高水平狀態。這一變化趨勢與Peng等〔12〕在幼鼠中的研究相一致，而非難治性癲癇中mir-134表達卻無變化。由此我們肯定mir-134參與了難治性癲癇的發生發展過程。

已有研究證明，Pum2 mRNA是mir-134的靶向基因，活性誘導的mir-134高表達能抑制Pum2的表達，促進樹突的生長，但在誘導mir-134表達的同時再過表達Pum2時，這種促進樹突生長的易化作用便不能表現出來，說明mir-134促進樹突生長是通過負性調控Pum2起作用的。所以我們對癲癇模型中Pum2的表達也進行了研究，雙標免疫熒光結果顯示Pum2位于神經元胞質內和樹突上，這與mir-134的表達部位相接近，并且蛋白免疫印跡表明在癲癇模型中Pum2的表達均較對照組低，與mir-134表達趨勢相反，這一變化可能是由于mir-134表達升高對Pum2的抑制作用增強所致。Pum2的C末端有8個α螺旋重復序列串聯構成的高度保守的PUM-HD，可以與特異性的單鏈RNA(即mRNA)結合，抑制翻譯功能的進行，負性調控靶基因的表達。目前已經有大量研究表明Pum2對樹突的生長具有負性調控作用〔6，13〕。在體外干擾了Pum2表達的海馬神經元中觀察到樹突的生長、分支復雜度以及樹突上興奮性突觸的數量均高于對照組，而過表達Pum2則會觀察到相反的結果。除此之外，Pum2還能與許多mRNA結合，抑制其他蛋白的表達，其中一些與癲癇的發生密切相關。比如Pum2可以與細胞外信號調節激酶2(Erk2)和p38α mRNA的3'UTR結合，對絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路進行調控〔14〕。MAPK是一族可以激活其他細胞因子的蛋白激酶，其活化在癲癇神經元死亡及反應性增生中都發揮了積極的作用。還有大量研究顯示Pum2可以調控NaV的表達，通過對動作電位的影響改變神經元的興奮性，當神經的元過度興奮放電就會導致癲癇的發生。一方面Pum2結合到神經元具有興奮性的NaV1.6 mRNA上〔15〕，抑制NaV1.6的表達對神經元的興奮性發揮直接調控作用;另一方面Pum2也可以通過對活化的蛋白激酶C受體1(RACK1)的負性調節在神經元興奮性調節中發揮間接作用〔16〕。RACK1使海馬GABA能中間神經元上的Nav1.1表達降低〔17〕，發放的抑制性沖動相對減少，神經元興奮性升高。所以，當Pum2表達下降時腦內神經興奮性升高是促進癲癇發生的重要因素。

綜上所述，根據本文結果可以推測mir-134/Pum2通路參與了難治性癲癇的形成過程，為進一步的機制研究奠定了基礎。雖然mir-134與Pum2的變化趨勢相符，提示mir-134通過Pum2而發生作用參與到癲癇的發展，但是mir-134可以不只作用于Pum2一個靶點，Pum2也不只是受到mir-134的調控，多種分子都可以影響突觸重組，所以，我們研究的只是一種現象的變化，不能除外其他影響因素的作用。

1 Wu Y，Liu D，Song Z.Neuronal networks and energy bursts in epilepsy〔J〕.Neuroscience，2014;〔Epub ahead of print〕

2 Fang M，Xi ZQ，Wu Y，et al.A new hypothesis of drug refractory epilepsy:neural network hypothesis〔J〕.Med hypoth，2011;76(6):871-6.

3 Henshall DC.MicroRNA and epilepsy:profiling，functions and potential clinical applications〔J〕.Curr Opio Neurol，2014;27(2):199-205.

4 Jimenez-Mateos EM，Engel T，Merino-Serrais P，et al.Antagomirs targeting microRNA-134 increase hippocampal pyramidal neuron spine volume in vivo and protect against pilocarpine-induced status epilepticus〔J〕.Brain Struct Funct，2014;〔Epub ahead of print〕

5 Fiore R，Khudayberdiev S，Christensen M，et al.Mef2-mediated transcription of the miR379-410 cluster regulates activity-dependent dendritogenesis by fine-tuning Pumilio2 protein levels〔J〕.EMBO，2009;28(6):697-710.

6 Vessey JP，Schoderboeck L，Gingl E，et al.Mammalian Pumilio 2 regulates dendrite morphogenesis and synaptic function〔J〕.Proceed Nat Acad Sci USA，2010;107(7):3222-7.

7 Lin WH，Baines RA.Regulation of membrane excitability:a convergence on voltage-gated sodium conductance〔J〕.Mol neurobiol，2014;〔Epubhead of print〕

8 Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure〔J〕.Electroencephal Clin Neurophys，1972;32(3):281-94.

9 Curia G，Longo D，Biagini G，et al.The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy〔J〕.J Neurosci Method，2008;172(2):143-57.

10 Schratt GM，Tuebing F，Nigh EA，et al.A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development〔J〕.Nature，2006;439(7074):283-9.

11 Jimenez-Mateos EM，Engel T，Merino-Serrais P，et al.Silencing microRNA-134 produces neuroprotective and prolonged seizure-suppressive effects〔J〕.Nat Med，2012;18(7):1087-94.

12 Peng J，Omran A，Ashhab MU，et al.Expression patterns of miR-124，miR-134，miR-132，and miR-21 in an immature rat model and children with mesial temporal lobe epilepsy〔J〕.J Mol Neurosci:MN，2013;50(2):291-7.

13 Ye B，Petritsch C，Clark IE，et al.Nanos and Pumilio are essential for dendrite morphogenesis in Drosophila peripheral neurons〔J〕.Curr Biol:CB，2004;14(4):314-21.

14 Lee MH，Hook B，Pan G，et al.Conserved regulation of MAP kinase expression by PUF RNA-binding proteins〔J〕.PLoS Genetics，2007;3(12):e233.

15 Driscoll HE，Muraro NI，He M，et al.Pumilio-2 regulates translation of Nav1.6 to mediate homeostasis of membrane excitability〔J〕.J Neurosci，2013;33(23):9644-54.

16 Fox M，Urano J，Reijo Pera RA.Identification and characterization of RNA sequences to which human PUMILIO-2(PUM2)and deleted in Azoospermia-like(DAZL)bind〔J〕.Genomics，2005;85(1):92-105.

17 Dong ZF，Tang LJ，Deng GF，et al.Transcription of the human sodium channel SCN1A gene is repressed by a scaffolding protein RACK1〔J〕.Mol Neurobiol，2014;50(2):438-48.