抗戾解毒湯體內抑制小鼠高致病性禽流感病毒 H5N1增殖

李佩瓊 章 鈞 曾 軍 王 芳 田 琪

(廣州醫科大學基礎學院醫學遺傳與細胞生物學教研室，廣東 廣州 510182)

2013年3月底，中國發生人感染H7N9亞型禽流感病毒重大疫情〔1～3〕。高致病性禽流感病毒的感染會給動物和人類帶來難以承受的，甚至導致死亡的病癥〔4〕，特征主要表現為機體的免疫系統所介導產生的細胞因子風暴以及病毒增殖所導致的多器官衰竭〔5〕。文獻表明〔6〕，中醫藥在抑制頑固病毒方面往往具有較好的效果。本研究評價抗戾解毒湯對于感染小鼠病毒抑制作用和保護作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所用流感病毒為 A/環境/青海/1/2008(H5N1)，所用C57BL/6小鼠為6～8周齡，購自上海源葉生物科技有限公司，奧司他韋購自上海羅氏制藥有限公司。抗戾解毒湯為本院配制，處方:佩蘭10 g、藿香10 g、姜黃10 g、白僵蠶10 g、竹茹 10 g、枳實 10 g、法半夏 10 g、青蒿 10 g，柴胡 15 g、草果 15 g、魚腥草 15 g、黃芩 15 g、大黃 5 g、炙甘草 5 g、陳皮 5 g、茯苓20 g、蟬蛻6 g。小鼠的體重及精神狀況實驗前無顯著差異，具有可比性。

1.2 小鼠的死亡保護率檢測 隨機分為實驗組，奧司他韋組和對照組各30只，小鼠麻醉(乙醚)后，使用高致病性禽流感病毒H5N1的鼠適應株滴鼻以感染，感染后120 min內，實驗組給予10 mg/kg的抗戾解毒湯灌胃，奧司他韋組給予5 mg/kg奧司他韋溶液腹腔注射，對照組給予PBS緩沖液灌胃，持續給藥至感染后5 d。記錄小鼠在感染病毒時及給藥后的臨床癥狀、生存情況及體重變化。

1.3 檢測肺部病毒負載水平 隨機分為實驗組、奧司他韋組和對照組各15只，按照1.2中相同方法進行麻醉，感染以及給藥，在小鼠感染后的第2、4、7天于每組隨機通過無菌操作取5只小鼠肺臟，使用液氮速凍，之后使用研缽進行研磨，再通過Easy PureTMRNA Kit試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)提取小鼠肺臟的總RNA，操作嚴格按照試劑盒的說明書進行。通過TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)提取RNA的反轉錄cDNA，具體操作嚴格按照試劑盒的說明書進行。根據文獻報道〔7〕的H5亞型禽流感病毒遺傳信息中的NP基因序列為模版比較其同源性，擴增區域選擇的是保守序列，最后使用BLAST軟件程序以及Primer 5.0引物設計的軟件進行特異性擴增引物的設計。最后通過TransStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)以及Stratagen MX3000p定量熒光PCR儀(美國安捷倫公司)進行感染小鼠的肺部病毒水平實時PCR檢測，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行one way ANOVA和χ2分析。

2 結果

2.1 3組生存保護情況對比 3組均從感染第2天開始出現體重的下降，并且對照組第3天有死亡現象出現，持續到感染后的第9天，之后未死亡小鼠開始恢復體重，于第10天停止死亡，其死亡率為96.7%(29/30)，存活率為3.3%;奧司他韋組感染第4天開始出現死亡，持續至第8天，停止死亡，未死亡小鼠由第10天開始恢復體重，其死亡率為46.7%(14/30)，存活率為53.3%，實驗組感染后第5天開始出現死亡，持續至第8天，停止死亡，未死亡小鼠由第5天開始恢復體重，其死亡率為20.0%(6/30)，存活率為80.0%。與奧司他韋組和對照組比較，實驗組生存率顯著提高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組生存率及體重變化(±s，n=15)

表1 各組生存率及體重變化(±s，n=15)

與實驗組比較:1)P＜0.05

組別 生存率(%)體重(g)第3天 第4天 第6天 第8天 第10天 第2天 第4天 第6天 第8天 第10天對照組 93.3 66.7 33.31) 13.31) 3.31) 17.8±0.1 15.3±0.1 13.1±0.3 11.5±0.61)11.6±0.11)7.3±0.4 18.6±0.1 18.8±0.3奧司他韋組 100.0 93.3 73.3 53.31) 53.31) 18.9±0.3 17.0±0.2 15.3±0.1 14.7±0.3 15.0±0.21)實驗組 100.0 100.0 86.7 80.0 80.0 18.8±0.2 17.1±0.1 1

2.2 3組肺部病毒增殖情況對比 感染2、4 d，與對照組比較，實驗組和奧司他韋組肺部流感病毒增殖明顯受抑制(P＜0.05)。實驗組效果要比奧司他韋組弱，差異無統計學意義。感染7 d，實驗組效果比奧司他韋組略高，差異無統計學意義，兩組與對照組均有顯著差異(P＜0.05)。見表2。

表2 各組肺部病毒增殖情況(±s，倍數，n=15)

表2 各組肺部病毒增殖情況(±s，倍數，n=15)

與對照組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 第2天 第4天 第7天對照組奧司他韋組實驗組1.02±0.10 0.14±0.011)0.29±0.131)1.02±0.10 0.14±0.022)0.23±0.111)1.02±0.11 0.14±0.011)0.14±0.031)

3 討論

禽流感H5N1病毒是一種RNA病毒，負鏈，單股。它會導致哺乳動物、禽類及人類的嚴重疾病，全世界每年的流感、新毒株的產生以及季節性的流感都源自于流感病毒的變異〔8～10〕。目前，獲批有效防治流感病毒的抗病毒藥物有兩類，M2離子通道阻滯劑和神經氨酸酶抑制劑(NAI)。前者的缺點為不良反應大，短時間內可出現藥物耐藥性，并且對 B型流感病毒無效〔11〕。而NAI較昂貴，但對A、B型流感病毒均有效，不良反應小，且可以減少藥物耐藥性的出現〔12〕。據報道，金剛烷胺等藥物可以用來抗禽流感H5N1病毒〔13，14〕。但是，目前在美國幾乎所有流行的甲型流感病毒株，對金剛烷胺或者奧司他韋均出現一定程度的耐藥性〔15〕。

本次研究提示，抗戾解毒湯的體內抑制病毒的效果相較于奧司他韋略低，然而在整個感染周期中，抗戾解毒湯在降低小鼠死亡率作用方面較奧司他韋有一定優勢。流感病毒在感染機體之后，首先識別機體的天然免疫體系，從而使機體天然抗病毒免疫作用被啟動，免疫細胞、趨化因子和促炎性的細胞因子被分泌，以對抗病毒感染，但是免疫細胞、趨化因子和促炎性的細胞因子的過度釋放將會導致“細胞因子風暴”，造成機體嚴重的免疫性病理的損傷。抗戾解毒湯的部分組成中藥都具有抑制機體炎癥反應的作用。因此，推測抗戾解毒湯的體內抑制促炎性的細胞因子的作用，減緩免疫應答劇烈程度，從而在某種程度上提高H5N1病毒感染小鼠的存活率。

綜上，抗戾解毒湯對感染H5N1病毒的小鼠的病毒增殖抑制作用明顯，且保護作用強，可以作為流感病毒的備選或者輔助藥物。

1 Gao R，Cao B，Hu Y，et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus〔J〕.N Engl J Med，2013;368(20):1888-97.

2 Gao HN，Lu HZ，Cao B，et al.Clinical findings in 111 cases of influenza A(H7N9)virus infection〔J〕.N Engl J Med，2013;368(24):2277-85.

3 Kageyama T，Fujisaki S，Takashita E，et al.Genetic analysis of novel avian A(H7N9)influenza viruses isolated from patients in China〔J〕.Euro Surveill，2013;18(15):20453.

4 Zhou H，Zheng Y，Wang L，et al.First serologic study for influenza A(H7N9)virus among veterinarians in Guangdong，China〔J〕.J Clin Virol，2014;60(2):182-3.

5 Russell CJ，Webster RG.The genesis of a pandemic influenza virus〔J〕.Cell，2005;123(3):368-71.

6 Gu S，Yin N，Pei J，Lai L.Understanding molecular mechanisms of traditional Chinese medicine for the treatment of influenza viruses infection by computational approaches〔J〕.Mol Biosyst，2013;9(11):2696-700.

7 張秀美，沈志勇，胡北俠，等.H5亞型禽流感病毒分離株HA基因序列分析和同源性比較〔C〕.大連:中國畜牧獸醫學會禽病學分會禽流感及免疫抑制病論壇，2005:29-33.

8 Neumann G，Noda T，Kawaoka Y.Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus〔J〕.Nature，2009 Jun 18;459(7249):931-9.

9 Zhu H，Webby R，Lam TT，et al.History of Swine influenza viruses in A-sia〔J〕.Curr Top Microbiol Immunol，2013;370:57-68.

10 Lu X，Liu F，Zeng H，et al.Evaluation of the antigenic relatedness and cross-protective immunity of the neuraminidase between human influenza A(H1N1)virus and highly pathogenic avian influenza A(H5N1)virus〔J〕.Virology，2014;(454-455C):169-175.

11 Hayden FG.Combination antiviral therapy for respiratory virus infections〔J〕.Antiviral Res，1996;29(1):45-8.

12 Ilyushina NA，Bovin NV，Webster RG，et al.Combination chemotherapy，a potential strategy for reducing the emergence of drug-resistant influenza A variants〔J〕.Antiviral Res，2006;70(3):121-31.

13 Zhang Y，Liu Q，Wang D，et al.Simultaneous detection of oseltamivirand amantadine-resistant influenza by oligonucleotide microarray visualization〔J〕.PLoS One，2013;8(2):e57154.

14 Seo S，Englund JA，Nguyen JT，et al.Combination therapy with amantadine，oseltamivir and ribavirin for influenza a infection:safety and pharmacokinetics〔J〕.Antivir Ther，2013;18(3):377-86.

15 Nguyen JT，Hoopes JD，Smee DF，et al.Triple combination of oseltamivir，amantadine，and ribavirin displays synergistic activity against multiple influenza virus strains in vitro〔J〕.Antimicrob Agents Chemother，2009;53(10):4115-26.