抗柯薩奇病毒B病毒性心肌炎膠囊復方提取物對病毒性心肌炎小鼠心肌的保護作用

林 清 馬會霞 高秀娟 謝 飛 徐 靜 王 巍 包巨太

(河北聯合大學中醫學院，河北 唐山 063000)

病毒性心肌炎(VMC)的發病機制尚不清楚，西醫缺乏滿意的治療效果，中醫藥治療VMC是目前研究的熱點，并取得了一定的成績。抗柯薩奇病毒B病毒性心肌炎膠囊(K-CoxB-JN)是在中醫理論指導下研制而成的中藥復方制劑，對于VMC的治療具有較好的療效〔1，2〕。本實驗通過建立阿霉素(ADM)誘導小鼠心肌損傷模型，探討K-CoxB-JN復方提取物對心肌保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性昆明小鼠，體質量(20±2)g，北京華埠康生物科技股份有限公司，動物合格證號SCXK(京)2009-0004，實驗過程中對動物的處置符合國家科技部2006年9月頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中動物倫理學標準。

1.1.2 藥品與試劑 K-CoxB-JN復方藥材(西洋參、黃芪、丹皮、麥冬、五味子、萊菔子、王不留行)購自石家莊市柏林藥材加工廠(批號20100225);ADM，購自浙江海正藥業股份有限公司，批號:20040416;血清肌酸激酶(CK)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，批號:20100111;磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)測定試劑盒 購自南京建成生物工程研究所，批號:20100111;心肌肌鈣蛋白I(cTnI)測定試劑盒，購自德國Bgaer公司;K-CoxB-JN復方提取物總黃酮、總皂苷由本課題組自制。

K-CoxB-JN復方總黃酮及總皂苷提取方法:采用乙醇回流提取的方法，首先稱取藥材，置圓底燒瓶中，分別一次加入8倍量和6倍量濃度為80%乙醇，然后加熱回流提取3次，每次2 h，將最終3次提取的藥液合并，過濾，通過旋轉蒸發儀回收乙醇同時濃縮藥液。(1)最后濃縮液分別用石油醚及乙酸乙酯等體積萃取3次，取上清液，合并濃縮提取液，剩余藥液70℃水浴蒸發成膏狀，之后在70℃鼓風干燥機中干燥即得總黃酮。(2)濃縮液分別用石油醚及正丁醇等體積萃取3次，取上清液，合并提取液，再用旋轉蒸發器回收正丁醇，剩余藥液70℃水浴蒸發成膏狀，在65℃鼓風干燥箱中干燥至恒重，即得總皂苷。

K-CoxB-JN復方水提物制備方法:首先稱取藥材，分別加入8、6倍量水煎煮2次，每次2 h，合并提取液，趁熱過濾，濾液濃縮、干燥至恒重即得水提物。

1.1.3 實驗儀器 電子天平，購自上海精密儀器儀表有限公司;電子調溫電熱套購自天津市泰斯特儀器有限公司，型號:98-1-B;旋轉蒸發儀購自上海亞榮生化儀器廠，型號:RE-5205;全自動生化分析儀，購自北京朗普信科技有限公司;低溫離心機，購自上海安亭科學儀器廠，型號TDL-5-A;電熱鼓風干燥箱，購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠，型號:GZX-9070 MBE;Bio-Rad3550型自動酶聯免疫測定儀，購自美國Bio-Rad公司;BX30型Olympus光學顯微鏡，購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 小鼠105只，隨機分為正常對照組、模型組、K-CoxB-JN總黃酮低劑量組(HL)、K-CoxB-JN總黃酮中劑量組(HM)、K-CoxB-JN總黃酮高劑量組(HH)，K-CoxB-JN總黃酮中劑量及總皂苷中劑量組(H+Z)，K-CoxB-JN水提物組(W)，每組15只。正常對照組生理鹽水(NS)灌胃，0.2 ml/10 g，1次/d，連續 7 d，第 7天灌胃 2 h后腹腔注射 NS 20 mg/kg;模型組，NS灌胃同正常對照組，第7天灌胃2 h后成腹腔注射ADM 20 mg/kg;HL組，給藥劑量相當于成人劑量的5倍(0.2 g/kg)，0.2 ml/10 g灌胃給藥，1 次/d，連續 7 d，第 7 天灌胃2 h后腹腔注射ADM 20 mg/kg，建立急性心肌損傷模型;HM組，給藥劑量相當于成人劑量的10倍(0.4 g/kg)，給藥方式及構建模型同HL組;HH組，給藥劑量相當于成人劑量的20倍(0.8 g/kg)，給藥方式及構建模型同HL組;H+Z組，給藥劑量相當于成人劑量的10倍(0.4 g/kg)，給藥方式及構建模型同HL組;W組，給藥劑量相當于成人劑量的10倍(0.4 g/kg)，給藥方式及構建模型同HL組。根據癥狀及血清心肌酶活力輔以心電圖檢查確定模型是否成功。

1.2.2 組織病理學檢測 心室用10%甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察。

1.2.3 心脾指數測定 小鼠心臟、脾臟稱重，脾指數=脾臟質量(mg)/體重(g);心臟指數=心臟質量(mg)/體重(g)。

1.2.4 血清CK、CK-MB、cTnI測定 小鼠急性心肌損傷模型建立24 h后，摘取小鼠眼球取血，用酶標儀測定CK、CK-MB、cTnI吸光度值，按試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 組織病理學檢測結果 正常對照組小鼠心肌無明顯病理變化;模型組目鏡下可見乳白色點狀、條索狀樣病變;K-CoxBJN總黃酮及黃酮+皂苷組炎性和壞死病理改變明顯輕于模型組。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學檢測結果(HE，×200)

2.2 心脾指數測定結果 K-CoxB-JN黃酮中、高劑量及黃酮+皂苷組心臟指數與模型組比較有統計學意義(P＜0.01)，KCoxB-JN黃酮中劑量組及黃酮+皂苷組的小鼠脾臟指數與模型組比較有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 血清 CK、CK-MB、cTnI測定結果 K-CoxB-JN黃酮低、中、高及黃酮+皂苷組均能降低CK和cTnI水平，與模型組比較有統計學意義(P＜0.01)，K-CoxB-JN黃酮低劑量組及黃酮+皂苷組降低CK-MB水平，與模型組比較有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

表1 K-CoxB-JN復方提取物對小鼠心臟指數和脾臟指數的影響(n=15，±s)

表1 K-CoxB-JN復方提取物對小鼠心臟指數和脾臟指數的影響(n=15，±s)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

組別 心臟指數 脾臟指數正常對照組 0.426 5±0.023 12) 0.115 4±0.010 72)模型組 0.474 7±0.014 2 0.184 7±0.020 6 HL組 0.464 3±0.025 7 0.164 5±0.032 1 HM組 0.446 8±0.046 92) 0.155 6±0.025 91)HH組 0.443 5±0.036 72) 0.165 3±0.024 7 H+Z組 0.438 8±0.019 82) 0.153 5±0.012 41)W組 0.449 8±0.025 71) 0.152 9±0.024 11)

表2 K-CoxB-JN復方提取物對小鼠血清CK、CK-MB、cTnI水平的影響(n=15，±s)

表2 K-CoxB-JN復方提取物對小鼠血清CK、CK-MB、cTnI水平的影響(n=15，±s)

cTnI正常對照組 1 067.2±84.32) 567.7±43.82) 1.04±0.072)組別 CK(U/L) CK-MB(U/L)模型組 1 641.4±97.8 845.6±99.7 2.15±0.51 HL組 1 109.6±201.62) 661.5±73.62) 1.40±0.222)HM組 1 159.3±223.72) 723.8±45.61) 1.08±0.172)HH組 1 176.5±128.92) 689.4±84.71) 1.32±0.192)H+Z組 1 106.7±195.82) 662.8±94.52) 1.13±0.562)W組 1 258±104.21) 675.5±88.11) 1.59±0.231)

3 討論

VMC是心血管常見疾病之一，發病趨勢逐年增長，與擴張型心肌病有一定聯系〔3〕。因此，早期診斷和治療VMC十分重要。K-CoxB-JN由西洋參、麥冬、丹皮、五味子、黃芪等中藥組成，西洋參莖葉皂苷對于心臟具有保護作用，馬寶蘭等〔4，5〕研究發現西洋參莖葉總皂苷可降低CK的活性，西洋參二醇組皂苷注射液對病人缺血再灌注損傷的心肌具有保護作用。黃芪具有抗病毒、改善微循環、促進心肌供氧、降低心肌耗氧量、免疫等作用〔6〕，對心血管具有一定的保護作用。

心肌酶檢查對診斷心肌損傷有一定輔助作用。VMC患者中，心肌損害通常伴隨心肌酶學的改變，如果心肌細胞發生壞死、破裂，心肌細胞膜通透性增加時，心肌酶就會釋放入血，導致血清心肌酶升高。CK是人體能量代謝過程中重要的酶類，存在于動物的心臟、腦以及肌肉等組織的細胞質和線粒體中。VMC時，CK比其他酶出現早，在2～6 h開始升高，并迅速升至高峰，是應用最廣泛的心肌損傷指標。CK有3個同工酶即CKMM、CK-MB、CK-BB，CK-MB多存在于心肌，可反映心肌損傷的情況，對心肌損害的早期診斷具有重要價值，是心肌早期損害和損害程度的較敏感和特異的血清標志物〔7〕。心肌肌鈣蛋白(cTn)由3個亞單位組成，即cTnT、cTnI、cTnC，cTn在鈣離子條件下形成復合物，主要分布于心肌和骨骼肌中，有不同的基因編碼。研究表明，cTnI僅在心肌細胞中表達，在人體骨骼肌細胞中不表達。在心肌中，cTnI的含量是CK-MB的13倍，并且在正常情況下的血循環中不會出現，當心肌損傷后很快釋放入血液中，其升高程度與病理嚴重程度有平行關系〔8〕，檢測外周血cTnI含量可反映心肌細胞的損傷程度〔9〕。由于cTnI變化在VMC中具有較高的特異性和靈敏性，目前已經確定cTnI對VMC心肌損傷的診斷價值。

本實驗顯示，K-CoxB-JN總黃酮低、中、高三個治療組、總黃酮+皂苷組及水提物組均能降低CK、CK-MB和cTnI水平，并且總黃酮+皂苷組優于水提物組，為進一步提取復方中的有效成分打下了基礎。VMC的發病機制十分復雜，與病毒直接作用、細胞毒作用、免疫損傷及一些生化機制等均有一定的關系。本實驗K-CoxB-JN提取物能降低CK、CK-MB和cTnI的活性，為下一步研究K-CoxB-JN提取物治療VMC做準備，也為KCoxB-JN提取物單體更好地應用于臨床提供理論及實驗基礎。

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5 李 潔，韓淑英，馬會霞，等.抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊總黃酮對小鼠急性阿霉素心肌損傷的保護作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2011;17(19):207-9.

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8 Smith SC，Ladenson JH，Mason JW，et al.Elevation of cardiac troponin I associatedwith myocardtis〔J〕.Circulation，1997;95(1):163-8.

9 余新超，鄭芙林，汪思應，等.急性病毒性心肌炎血清肌鈣蛋白I的表達及臨床意義〔J〕.中國基層醫藥雜志，2002;9(12):1067-8.