有氧運動對衰老大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞自發瞬時外向流的影響

張寒夢 劉雨佳 石麗君(北京體育大學，北京 100084)

大電導鈣激活鉀通道(BKCa)是血管平滑肌細胞上廣泛分布的一類K+通道，在血管張力的調節中發揮著重要的負反饋調控作用〔1，2〕。自發瞬時外向流(STOCs)反饋性抑制VGCC，降低〔Ca2+〕i，對抗平滑肌的收縮，促使平滑肌舒張〔3〕。衰老會導致血管中間層彈性物質的丟失，可誘導機體動脈結構和功能發生重構〔4〕，其中血管離子通道的表達和功能亦發生改變〔5〕。衰老可引起某些血管床BKCa通道的表達和功能下調〔6〕，使動脈的舒張能力減弱，外周阻力增高，從而血壓升高。與衰老相反，有氧運動對血壓的穩定及血管功能的改善是有益的〔7，8〕。在青年大鼠腸系膜動脈上，有氧運動可以通過上調BKCaβ1亞基的功能使通道活性增加，從而誘發血管舒張能力增強〔9〕。但是衰老腸系膜動脈上STOCs有何變化特征以及有氧運動對其有怎樣的調控作用，至今尚未見文獻報道。本研究探討有氧運動對衰老大鼠腸系膜阻力動脈平滑肌細胞STOCs的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 2月齡健康雄性Wistar大鼠購自北京維通利華實驗技術有限公司，飼養至19～21月齡(老年組)，隨機分為安靜組(O-SED，n=6)和有氧運動組(O-EX，n=6)。另選取2月齡雄性Wistar大鼠作為青年對照組(n=6)。按照國家標準嚙齒類動物飼料喂養大鼠，自由飲食，溫度維持在22℃～24℃，相對濕度40%～60%，晝夜節律人工控制光照(光照時間為6:00～18:00)。

1.2 訓練方案 O-EX組大鼠先進行1 w適應性跑臺訓練，之后進行 12 w 跑臺運動，坡度 0°，15 m/min，60 min/d，5 d/w。OSED組與Young組不運動。三組均于13 w結束后的24～48 h內取材。

1.3 主要試劑及藥品 牛血清蛋白(BSA)、I型膠原酶(type IS collagenase)、木瓜蛋白酶(papain)、F型膠原酶(type F collagenase)、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、Iberiotoxin(IbTX)、蘭諾定(Ryanodine)均購自美國Sigma公司，其余為國產分析純試劑。Anti-KCa1.1(BKCa)和Anti-sloβ1(KCNMB1)購自以色列alomone公司。

1.4 大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞分離 具體方法參見文獻〔9〕。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，麻醉后迅速取出腸系膜動脈置于4℃無鈣分離液(PSS)Ⅰ中，小心剝離干凈腸系膜動脈上周圍脂肪組織，并將其剪成0.5～1 mm的小段。將組織轉移入酶Ⅰ(mg/ml):0.3 papain、1 DTT 和 1 BSA，37℃溫育25 min;之后去除酶Ⅰ，加入酶Ⅱ:1.5F型膠原酶、1Ⅰ型腹原酶和1 BSA，消化10 min。消化完畢后，組織用PSSⅡ洗3～4遍，鈍頭吸管輕輕吹打，制備細胞懸液，4℃保存備用。分離平滑肌細胞緩沖液 PSSⅠ(mmol/L):137 NaCl，5.6 KCl，1.0 MgCl2，10.0 G-Glucose，10.0 HEPES，0.03 硝普納(NaOH 調節pH 至 7.4)。PSSⅡ(mmol/L):137 NaCl，5.6 KCl，1 MgCl2，10 HEPES，10 Glucose，0.42 Na2HPO4，0.44 NaH2PO4(NaOH 調節pH 至 7.3～7.4)。

1.5 電生理實驗 采用兩性霉素B穿孔全細胞膜片鉗技術記錄STOCs，終濃度為250 μg/ml。玻璃微管電極采用微管電極拉制儀(PC-10，Narishige，Japan)進行兩步拉制，毛細玻璃管購自美 國 Sutter instrument(BF150-86-10，I.D 1.5 mm，O.D 0.86 mm，fire polished)，拉制后電極尖端直徑約為 1～2 μm，充灌電極液后電極阻抗為4～5 MΩ。電極內液成分(mmol/L):110 冬氨酸鉀(K-Asp)，30 KCl，1 EGTA，3 Na2ATP，0.85 CaCl2，10 Glucose，10 HEPES(KOH調節 pH 至 7.2);浴液成分(mmol/L):134 NaCl，10 HEPES，1 MgCl2，6 KCl，10 Glucose，1.8 CaCl2(NaOH調節pH至7.4)。電流信號經膜片鉗放大器(Axon 700B amplifier)放大，采樣頻率10 kHz，八極Bessel低通濾波頻率為2 kHz，在Clampex 10.0軟件控制下，進行A/D、D/A轉換。采用 Mini Analysis 6.0 program(Synaptosoft，Inc.，Decatur，GA，USA)對STOCs進行分析，STOCs閾值設為10 pA。所有實驗記錄都在室溫(22℃～25℃)下進行。

1.6 蛋白免疫印跡分析各組腸系膜動脈BKCa通道α和β1亞基蛋白表達情況 稱取100 mg腸系膜動脈組織，迅速加入500 μlRIPA裂解液，用勻漿器在冰水浴中勻漿10次，每次4～5 s，間隔4～5 s。將勻漿液于4℃以13 000 r/min離心30 min，取上清液待測。按照常規操作進行蛋白濃度的測定、電泳樣品制備、聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(上樣量每孔40 μg蛋白)、轉膜(BKCaα 亞基300 mA 恒流1.5 h;BKCaβ1 亞基250 mA恒流50 min)、5%BSA封閉2 h。加入用0.01 mol/L Tris鹽酸緩沖液(TBST)稀釋的一抗〔Anti-KCa1.1(BKCa)，1∶300;Antisloβ1(KCNMB1)，1∶200;β-actin(R-22):sc-130657，1∶300〕，室溫脫色搖床上搖動孵育1 h，4℃孵育過夜;0.01 mol/L TBST漂洗三次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG〔1∶16 000(BKCaα 亞基);1∶2 000(BKCaβ1 亞基);1∶4 000(β-actin)〕孵育1 h。免疫蛋白活性由增強化學發光法檢測，并采用Quantity One軟件進行半定量分析。

1.7 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 STOCs的電壓依賴性及藥理學鑒定 鉗制電位(HP)為－50 mV，給予階躍電壓，即去極化步階10 mV，持續400 ms，遞增至80 mV，可記錄到全細胞的外向鉀電流。可見STOCs隨機性地疊加在全細胞電流上，隨著細胞膜去極化程度的增加，疊加在曲線上的STOCs幅度逐漸增加，但具有隨機性和不確定性。見圖1。如改變HP，分別鉗制在－40～0 mV，亦可記錄到STOCs(圖2A，2C，2D)。當 HP= －40 mV 時，STOCs出現的頻率和幅度均較低;當HP增加到－30 mV以上時，即可觀察到明顯的STOCs。STOCs的幅值隨著細胞膜去極化程度的增加呈現出顯著增加，表現為明顯的電壓依賴性特征。對比－40 mV，STOCs頻率亦顯著增加，但 －30 mV、－20 mV、－10 mV、0 mV之間無顯著差異。選用蘭諾定受體阻斷劑(RYR，50 μmol/L)或BKCa通道的特異性阻斷劑(IbTX，100 nmol/L)分別孵育細胞2 min，可見STOCs活性顯著被抑制(圖2B)，提示STOCs為蘭諾定受體和BKCa通道介導。

圖1 穿孔膜片鉗記錄2月齡青年大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞的STOCs(階躍電壓模式)

圖2 青年大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞STOCs電壓依賴性和藥理學鑒定

2.2 有氧運動對衰老腸系膜動脈平滑肌細胞STOCs的影響 在相同HP下，STOCs的幅值和頻率均為Young組最大，其次為O-EX組，而O-SED組最低。如圖3所示，當HP=－30 mV時，STOCs的幅值分別為(32.6±2.4)pA(Young)組、(11.4±0.7)pA(O-SED)組和(20.2±2.8)pA(O-EX)組;而頻率分別為(4.50±0.40)Hz(Young)組、(1.40±0.20)Hz(O-SED)組和(2.50±0.40)Hz(O-EX)組。與 Young組比較，老年組(OSED和O-EX)STOCs的幅值和頻率均顯著下降(P＜0.01);而進行有氧運動訓練的老年組(O-EX)又顯著高于安靜組(OSED，P＜0.01)，提示有氧運動顯著抑制了衰老誘發的STOCs活性減弱。

圖3 有氧運動對衰老大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞STOCs的影響

2.3 有氧運動對衰老腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa通道α和β1亞基表達的影響 分別采用BKCa通道α和β1亞基的特異性抗體〔Anti-KCa1.1(BKCa)和 Anti-sloβ1(KCNMB1)〕，可以檢測到125 kD(α亞基)和28 kD(β1亞基)的蛋白表達。與Young組相比，O-SED組和O-EX組α和β1亞基表達均顯著下降(P＜0.01);然而O-EX組卻顯著高于 O-SED組(P＜0.01)。α亞基蛋白表達:Young組(1.00±0.00)＞ O-EX組(0.72±0.17)＞O-SED組(0.65±0.11)。β1亞基蛋白表達亦呈此變化趨勢，Young組(1.00±0.00)＞ O-EX 組(0.65±0.05)＞O-SED 組(0.29±0.07)。見圖4。

圖4 有氧運動對衰老大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa通道α亞基和β1亞基表達的影響

3 討論

有氧運動的降壓效應已得到國內外專家普遍的肯定〔10〕，運動控制血壓的機制很多，其中運動對動脈平滑肌鉀離子通道的調控作用日益受到關注。本研究發現:(1)衰老使STOCs活性下降，表現為相同鉗制電位下STOCs的幅值和頻率均顯著降低;(2)蛋白免疫印跡分析顯示衰老細胞BKCa的α和β1亞基表達均下降;(3)有氧運動顯著抑制了上述衰老誘發的變化。此結果提示，衰老可以通過BKCa亞基分子表達下調的方式降低BKCa功能，并減弱內質網 RyRs和 BKCa之間的功能耦聯，使STOCs活性減弱，從而誘導膜去極化、血管外周阻力增加;而長期規律性有氧運動能顯著逆轉這些變化，這可能是運動改善衰老血管功能、緩解血管張力和降低血壓的重要機制之一。

在BKCa通道的研究過程中，常規全細胞模式會導致細胞內容物丟失、巨阻封接細胞脫落、細胞碎片堵住破口處造成記錄電流衰減假象等問題〔11〕。而且，由于細胞內鈣緩沖能力的變化，此模式很難記錄到STOCs〔12〕。因此常規全細胞膜片鉗記錄法在某些特定研究中受到限制。本實驗采用的是穿孔膜片鉗法，利用兩性霉素B在磷脂雙分子層中形成孔道，小孔的大小只允許一價離子通過，其優點主要有:(1)大分子和高價離子不通透，避免胞內重要物質滲析，因此對離子通道起調控作用的物質濃度不受影響，電流衰減現象減慢;(2)高阻封接很穩固，可長時間持續記錄;(3)電極串聯電阻并未升高且相當穩定，補償后準確性很好，減少了補償不準確帶來的誤差。本實驗選用穿孔膜片鉗模式，于急性分離的大鼠腸系膜平滑肌細胞上成功地記錄到了STOCs，記錄可持續1～2 h。

本實驗中記錄到的STOCs具有隨機性，幅值隨著細胞膜的去極化程度而呈上升趨勢，表現為明顯的電壓依賴性。如上所述，STOCs使細胞膜首先復極化、超極化，隨后反饋性抑制VGCC，使其關閉，鈣內流減少，從而使胞內Ca2+濃度下降，血管舒張，完成對血管收縮的負反饋調節。因此，STOCs與RyRs以及BKCa的表達和功能有直接的關系。許多血管活性物質都是通過對鈣火花幅值和頻率的調控以及對RyRs與BKCa通道的耦聯來實現對血管張力的調節的〔13〕。Ryanodine是RyRs的特異性阻斷劑，它能夠以極高的親和力與RyRs迅速結合，完全阻斷RyRs的活動。而IbTX作為BKCa通道的特異性阻斷劑，可用于鑒別BKCa電流。本實驗結果說明STOCs確為RyRs和BKCa所介導。

本實驗還發現，有氧運動顯著逆轉了衰老誘發的STOCs活性減弱。由于STOCs是鈣火花誘發的臨近細胞膜上BKCa通道的開放，因此該通道在細胞膜上的表達密度將顯著影響STOCs的幅值。現已明確，血管平滑肌細胞BKCa由α和β1亞基組成，自發性高血壓大鼠的BKCa通道活性增強并伴有α亞基的表達增加〔13〕。另有研究證實β1亞基的下調或減少均可使BKCa通道功能下降〔14〕。Nishimaru等〔15〕檢測了幼齡和老齡 F344大鼠冠狀動脈的BKCa的亞基組成，發現增齡可導致α亞基和β1亞基蛋白表達和功能下降;但Nishimaru等〔16〕研究表明在衰老大鼠腦動脈BKCa表達并未發生變化，提示增齡所致的BKCa通道結構和功能變化有組織特異性。本研究結果提示，規律性有氧運動訓練可以顯著抑制BKCa通道組成亞基的蛋白表達下降，這可能是各組STOCs差異的重要原因。

綜上所述，衰老可誘發大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa的α和β1亞基下調，從而使STOCs減弱、膜去極化和外周阻力增加;而規律性有氧運動可顯著抑制此變化，這可能是運動誘導衰老血管逆重構、緩解血管張力增高的重要機制。

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