沙參麥冬湯對皮膚光老化模型小鼠的保護作用

王 璐 李中平 曹艷亞 杜 沛 沈紅藝 (上海中醫藥大學健康營養研究室，上海 20203)

皮膚光老化是指長期日光紫外線照射導致的皮膚衰老。皮膚光老化僅發生于光暴露部位，臨床表現主要包括皮膚干燥松弛、粗而深的皺紋、色素沉著異常及惡性腫瘤。沙參麥冬湯源于清代吳鞠通的《溫病條辨》，由沙參、麥冬、玉竹、天花粉、冬桑葉、生扁豆、生甘草7味藥組成，具有清養肺陰，潤燥生津之功效。現代藥理研究證明沙參、麥冬、玉竹及桑葉均具有一定抗氧化清除自由基的藥理活性〔1～4〕。自由基與皮膚光老化密切相關，提示沙參麥冬湯可能具有抗皮膚光老化的作用。本實驗利用沙參麥冬湯水提物對光老化小鼠的干預，探討沙參麥冬湯是否具有抑制皮膚光老化的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ICR小鼠30只，雌雄各半，清潔級，體重18～22 g，由上海西普爾-必凱實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購于南京建成生物研究所;小鼠透明質酸(HA)ELISA試劑盒購于上海基爾頓生物科技有限公司。沙參、麥冬、桑葉、玉竹、白扁豆、生甘草;桑葚、沙參、山藥、砂仁，藥材購于康橋飲片廠。藥液制備按常規煎煮去渣，濃縮。

1.3 儀器 飛利浦UVB光療燈(荷蘭飛利浦公司);TN2340紫外線強度檢測儀(臺灣泰納);高速電動勻漿器;JM-200型電子天平(上海衡津電子設備有限公司);冷凍離心機(德國 eppendorf公司);低溫冰箱(日本Sanyo公司);酶標儀(Biotek)。

1.4 分組及造模 將30只小鼠正常喂養1 w后，隨機分為5組，即空白組、模型組、陽性對照組、沙參麥冬湯高、低劑量組，剃毛刀剃去背部鼠毛，每組紫外照射前重復剃毛。造模方法，參考文獻光老化小鼠模型造模方法〔5〕，UVB光照劑量累計210 mJ/cm2。空白組每天灌胃生理鹽水;模型組紫外照射后，每天灌胃生理鹽水;陽性對照藥為補陰方〔6〕，給藥劑量為4.24 g/kg;沙參麥冬湯給藥各組紫外照射后，灌胃不同劑量的沙參麥冬湯水提物，高劑量組每天灌胃5.22 g/kg，低劑量組每天灌胃1.74 g/kg。實驗結束后麻醉下處死小鼠，取小鼠背部正中皮膚，測定皮膚SOD、GSH-Px、MDA、HA含量。

1.5 測定指標與方法 處死前動物稱重，禁食不禁水，24 h后空腹注射0.7 ml/100 g烏拉坦(濃度1 g/ml)，麻醉動物后，取光照部位全層皮膚組織(不含脂肪)，稱取100 mg，然后在生理鹽水中漂洗數次，濾紙拭干，加入0.9 ml PBS于高速電動勻漿器中制成10%組織勻漿(冰上);5 000 r/min 4℃離心10 min，取上清，－20℃冰箱保存待用。另取部分光照部位皮膚，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，做皮膚光老化病理組織學檢查。皮膚組織中HA含量測定采用 ELISA法，SOD、MDA、GSH-Px檢測按照試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 皮膚組織病理學檢查 HE染色顯示，光照模型組較空白對照組出現光老化病理變化:表皮不規則增厚，真皮層成纖維細胞排列不規則，炎性細胞浸潤增多。沙參麥冬湯給藥組，病理變化有明顯改善，真皮層較光照模型組成纖維細胞排列有序，且炎細胞浸潤減少。見圖1。

2.2 各組皮膚組織SOD活力比較 經紫外線照射后模型組小鼠皮膚組織SOD活性與空白組差異顯著(P＜0.01)。沙參麥冬湯高劑量組與低劑量組對紫外線照射引起的皮膚組織SOD活力下降均有顯著抑制作用(P＜0.01)。沙參麥冬湯低劑量組與模型組比較，SOD活力有所提高(P＜0.01)。沙參麥冬湯高劑量組與沙參麥冬湯低劑量組比較SOD活力有所提高(P＜0.01)。陽性對照組與沙參麥冬湯高劑量組比較SOD活力有所提高(P=0.008)。見表1。

2.3 各皮膚組織中GSH-Px活力比較 經紫外線照射后模型組小鼠皮膚組織GSH-Px活性降低與空白組差異顯著(P＜0.01)。沙參麥冬湯高劑量組與低劑量組對紫外線照射引起的皮膚組織GSH-Px活力下降均有顯著抑制作用。沙參麥冬湯低劑量組與模型組比較GSH-Px活力有所提高(P=0.015)。沙參麥冬湯高劑量組與低劑量組比較GSH-Px活力有所提高，陽性對照組與沙參麥冬湯高劑量組比較GSH-Px活力有所提高，但無統計學差異(P＞0.05)。見表1。

2.4 各組皮膚組織中MDA含量比較 經紫外線照射后模型組小鼠皮膚組織MDA含量與空白組比較差異顯著提高(P＜0.01)。沙參麥冬湯干預組對紫外線照射引起的皮膚組織MDA含量增多均有抑制作用。沙參麥冬湯低劑量組與模型組比較MDA含量有所減少(P=0.035)。沙參麥冬湯高劑量組與低劑量組比較MDA含量有所減少，陽性對照組與沙參麥冬湯高劑量組比較MDA含量有所減少，但均無統計學差異(P＞0.05)。見表1。

圖1 各組小鼠皮膚組織病理學觀察(HE，×100)

表1 各組ICR小鼠皮膚勻漿中SOD、GSH-Px、MDA及HA的含量(±s，n=6)

表1 各組ICR小鼠皮膚勻漿中SOD、GSH-Px、MDA及HA的含量(±s，n=6)

與空白組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 SOD(U/mgprot) GSH-Px(活力單位) MDA(nmol/mgprot) HA(μg/μl)空白組 146.19±16.712) 168.30±44.082) 12.47±2.562) 984.59±77.482)模型組 36.47±5.481) 28.94±14.101) 29.90±4.301) 529.87±103.381)陽性對照組 110.84±7.111)2) 88.17±14.071)2) 18.15±2.982) 984.04.±72.352)沙參麥冬湯高劑量組 94.28±9.951)2) 81.81±13.091)2) 22.03±8.491)2) 924.22±67.362)沙參麥冬湯低劑量組 70.73±5.661)2) 65.41±19.711)2) 23.35±4.801)2) 771.56±27.691)2)

2.5 沙參麥冬湯水提物對光老化皮膚組織HA含量的影響與空白組相比，紫外線光照可引起小鼠皮膚中HA含量下降(P＜0.01)。沙參麥冬湯干預組對紫外線照射引起的皮膚組織HA含量下降均有抑制作用。沙參麥冬湯低劑量組與模型組比較HA含量有所上升(P＜0.01)。沙參麥冬湯高劑量組與低劑量組比較HA含量有所上升(P＜0.01)，陽性對照組與沙參麥冬湯高劑量組比較HA含量有所上升，但不具有統計學差異(P＞0.05)。見表1。

3 討論

長期紫外線照射可造成皮膚不同程度的結構及功能性損傷，如灼傷、黑色素瘤皮膚癌及皮膚的過早老化。紫外線照射使皮膚中羥自由基、過氧化氫、超氧陰離子等活性氧簇(ROS)濃度升高，并抑制機體自身抗氧化防御系統，如抑制SOD及GSH-PX活性等，導致氧化應激及皮膚中蛋白質及其他大分子物質的氧化光損傷〔7，8〕。

低濃度的ROS為光老化機制中重要的第二信使，啟動紫外線輻射后的細胞信號傳導過程〔9，10〕。ROS介導轉錄因子復合體活化蛋白(AP-1)形成從而誘導基質金屬蛋白酶(MMPs)活化〔11〕，MMPs可降解幾乎所有的細胞外基質〔12〕。因此，長期UV照射會導致MMPs產生過量，繼而降解膠原蛋白等細胞外基質成分，引起皮膚干燥、松弛、皺紋形成等皮膚光老化改變〔13〕。

皮膚中的HA存在于細胞間的胞外基質中，與其他基質成分共同構成細胞間的填充物。HA具有很強的保水作用及營養皮膚功能〔14〕，長期紫外線照射導致HA含量減少，導致皮膚干燥、松弛等衰老癥狀〔5〕，Averbeck等〔15〕提出長期紫外線照射引起的皮膚中ROS含量的增多以及HA的降解可能是紫外線對皮膚損傷的特征性病變。

SOD、GSH-Px是正常皮膚中重要的酶性抗氧化物，可直接反映皮膚抗氧化防御系統的活性。MDA是反映機體氧化損傷程度的最經典也是最有效的指標之一〔16〕。

近年來有關皮膚光老化分子機制的研究多集中于MAPKs信號通路與 NF-κB 信號通路〔11，17～19〕。研究發現，活性氧族為光老化細胞信號通路的第二信使，刺激MMPs的過表達，降解大部分皮膚細胞外基質成分如前膠原蛋白。而對皮膚基質成分中另一重要的組分HA的研究尚較少。

本實驗結果提示沙參麥冬湯具有抗皮膚光老化作用，推測作用機制之一可能是通過提高SOD、GSH-Px活性，降低ROS含量，提高對自由基的清除能力，減少脂質過氧化物的堆積，抑制長期紫外線光照引起的皮膚中HA的減少，從而維持HA在保持皮膚含水量及營養皮膚方面的功能，抑制皮膚干燥粗糙及皺紋的生成。

“肺主皮毛”初見于《內經》，《素問·六節藏象論》云“肺者，……其華在毛，其充在皮。”《素問·經脈別論》云:“食氣入胃，濁氣歸心，淫精于脈，脈氣流經，經氣歸于肺，肺朝百脈，輸精于皮毛。”近年來，眾多學者對“肺主皮毛”的理論內涵進行探究，歐陽兵、王景明認為“皮毛”即皮膚和毛發〔20〕，王鳳儀等〔21〕認為衛氣、津液為肺主皮毛的媒介和途徑，肺氣宣發脾胃轉輸的水谷精微于皮毛，使皮毛不燥;肺氣宣發衛氣于皮毛，使皮毛不寒。沙參麥冬湯源于《溫病條辨》堪稱清養肺胃，生津潤燥代表方。方中沙參、麥冬為君藥，滋陰潤肺，清熱生津;玉竹甘平，養陰潤燥;天花粉甘寒，清熱生津，共為臣藥;扁豆、甘草益氣培中。全方共奏甘寒生津、清養肺胃之功效。近年來廣泛應用于皮膚科治療壓力性潰瘍、干燥綜合征等疾病。藥理研究發現，沙參麥冬湯可增強放射性肺炎大鼠肺組織SOD活性降低MDA含量〔22〕，沙參麥冬湯對肺間質纖維化大鼠氧自由基損傷及細胞外基質代謝的研究發現，其對肺間質纖維化大鼠的氧自由基損傷有不同程度的干預改善細胞外基質代謝〔23〕。此外，組成沙參麥冬湯的沙參，麥冬、玉竹及桑葉均具有一定抗氧化清除自由基的藥理活性。

1 于學康.麥冬的藥理作用研究進展〔J〕.天津藥學，2012;24(4):69-70.

2 張 濤，馬艷杰，王曉琴.沙參屬植物化學成分與藥理作用研究進展〔J〕.北方藥學，2013;10(6):74-5.

3 楊慧潔，楊世海，張海弢，等.玉竹化學成分、藥理作用研究進展及開發利用現狀〔J〕.人參研究，2012;24(3):40-5.

4 劉學銘，肖更生，陳衛東.桑葉的研究與開發進展〔J〕.中藥材，2001;24(2):144-7.

5 Guang Dai，Till Freudenberger，Petra Zipper，et al.Chronic ultraviolet B irradiation causes loss of hyaluronic acid from mouse dermis because of down-regulation of hyaluronic acid synthases〔J〕.Am J Pathol，2007;171(5):1451-61.

6 王 劍.補陰方對陰虛模型小鼠皮膚中透明質酸含量的作用〔J〕.中藥藥理與臨床，2003;19(5):42-3.

7 Vayalil PK，Mittal A，Hara Y，et al.Green tea polyphenols prevent ultraviolet light-induced oxidative damage and matrix metalloproteinases expression in mouse skin〔J〕.J Invest Dermatol，2004;122(6):1480-7.

8 Hwang BM，Noh EM，Kim JS，et al.Curcumin inhibits UVB-induced matrix metalloproteinase-1/3 expression by suppressing the MAPK-p38/JNK pathways in human dermal fibroblasts〔J〕.Exp Dermatol，2013;22(5):371-4.

9 楊 斌，郝 飛.皮膚光老化、活性氧簇與抗氧化劑〔J〕.中國美容醫學，2005;14(5):637-9.

10 Park M，Han J，Lee CS，et al.Carnosic acid，a phenolic diterpene from rosemary，prevents UV-induced expression of matrix metalloproteinases in human skin fibroblasts and keratinocytes〔J〕.Exp Dermatol，2013;22(5):336-41.

11 Yu BC，Lee DS，Bae SM，et al.The effect of cilostazol on the expression of matrix metalloproteinase-1 and type I procollagen in ultraviolet-irradiated human dermal fibroblasts〔J〕.Life Sci，2013;92(4-5):282-8.

12 Quan TH，Qin ZP，Fisher GJ，et al.Matrix-degrading Metalloproteinases in photoaging〔J〕.Invest Dermatol Symp Proceed，2009;14(1):20-4.

13 鄭錦芬，陸 春，賴 維.基質金屬蛋白酶與皮膚光老化〔J〕.中華醫學美學美容雜志，2012;18(1):75-7.

14 Robert S，Maibach HI.Hyaluronan in skin.Aspects of aging and its phar-macologic modulation〔M〕.Clin Dermatol，2008;26(1):106-22.

15 Averbeck M，Gebhardt CA，Voigt S，et al.Differential regulation of hyaluronan metabolism in the epidermal and dermal compartments of human skin by UVB irradiation〔J〕.Invest Dermatol，2007;127(3):687-97.

16 周湘君，葉才果，楊廣麗，等.丹酚酸B對小鼠皮膚光老化的保護效應〔J〕.中國組織工程研究，2013;17(2):275-9.

17 Park G，Kim HG，b Sim Y，et al.Sauchinone，a lignan from Saururus chinensis，protects human skin keratinocytes against ultraviolet B-induced photoaging by regulating the oxidative defense system〔J〕.Biol Pharm Bull，2013;36(7):1134-9.

18 Chiang HM，Chiu HH，Liao ST，et al.Isoflavonoid-rich flemingia macrophylla extract attenuates UVB-induced skin damage by scavenging reactive oxygen species and inhibiting MAP kinase and MMP expression〔J〕.Evid Based Compl Alt Med，2013;69-78，79

19 Hwang YP，Choi JH，Kim HG，et al.Cultivated ginseng suppresses ultraviolet B-induced collagenase activation via mitogen-activated protein kinases and nuclear factor kappa B/activator protein-1-dependent signaling in human dermal fibroblasts〔J〕.Nutr Res，2012;32(6):428-38.

20 李如輝，張曉蘋.肺主皮毛的研究進展〔J〕.福建中醫學院學報，2005;15(5):59-61.

21 王鳳儀，趙黨生.衛氣、津液——肺主皮毛的媒介和途徑〔J〕.中醫研究，2009;22(12):4-6.

22 周燕萍，胡作為，楊 航.沙參麥冬湯對放射性肺炎大鼠肺組織超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量的影響〔J〕.湖北中醫藥大學學報，2011;13(4):9-11.

23 韓穎萍，黃 霞，劉惠霞.沙參麥冬湯對肺間質纖維化大鼠氧自由基損傷及細胞外基質代謝的影響〔J〕.中華中醫藥雜志，2011;26(9):2169-71.