轉錄因子T-bet、GATA-3在哮喘模型大鼠肺組織中的表達及歸喘寧滴丸的干預作用

王志旺 孫少伯 郭 玫 程小麗 朱 冉 藺興遙 王瑞瓊(甘肅中醫學院，甘肅 蘭州 730000)

中藥當歸為傘形科植物當歸Angelica Sinensis(oliv.)Diels干燥根，有補血活血、調經止痛、潤腸通便的功能，主治血虛萎黃、月經不調、腸燥便秘等癥，自古一直被中醫廣泛用于多種疾病的治療，素有“十方九歸”之稱。當歸治療哮喘自古就有記載，《神農本草經》、《本草綱目》、《本草圖經》以及《慎齋醫書》等著作中都有當歸治療哮喘的理論與臨床應用，如《神農本草經》中記載當歸“為補血活血要藥，故主咳逆上氣也”。研究發現當歸揮發油對豚鼠離體痙攣狀態氣管平滑肌有明顯的解痙作用〔1〕，本次實驗以哮喘大鼠行為學、肺組織T-bet和GATA-3蛋白表達水平以及肺組織病理學等為研究指標，探討歸喘寧滴丸對實驗性哮喘大鼠的平喘作用。

1 材料與方法

1.1 動物、受試劑及儀器 雌性SD大鼠，體質量115～145 g，SPF級，由甘肅中醫學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(甘)2004-0006。甘肅中醫學院實驗動物中心飼養，普通飲食及飲水。歸喘寧滴丸，甘肅中醫學院中藥化學研究室提供;醋酸地塞米松片，批準文號:國藥準字H33020822，浙江仙琚制藥股份有限公司生產，產品批號:111068;卵清白蛋白(OVA)，Grade V，Sigma公司產品;吐溫-80，上海大眾制藥廠，生產批號:70093;抗體T-bet、抗體GATA-3購于美國Santa Cruz公司。實驗時，用0.8%吐溫-80配制歸喘寧滴丸(按當歸揮發油計算:1.6%、0.8%、0.4%)與地塞米松(0.005%)乳狀液，另配制0.8%吐溫-80的空白對照液，冷藏備用。420AI超聲霧化器，江蘇魚躍醫療設備股份有限公司生產;TGL-16G高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;722型分光光度計，上海第三分析儀器廠產品;BS1103型Sartorius電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市正基儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物篩選 將大鼠放于自制的密閉玻璃箱內，超聲霧化0.5%磷酸組胺生理鹽水溶液刺激大鼠，觀察大鼠吸入組胺后的呼吸變化情況，選擇吸入組胺后20 s內出現呼吸急促、前肢縮抬、點頭或腹式呼吸等哮喘癥狀的大鼠作為實驗用大鼠。

1.2.2 分組、造模與給藥 取篩選合格雌性大鼠〔2〕54只，按體重分層隨機分為6組，即正常對照組、模型對照組、地塞米松組、當歸喘寧滴丸高、中、低劑量組，分籠飼養，自由進食去OVA的特殊飼料和水。致敏時，除正常對照組外，各組于第1天、第8天用新鮮配制的OVA 50 mg(5%)與含100 mg(10%)氫氧化鋁凝膠的生理鹽水混懸液共1 ml，在大鼠兩后足跖、兩側腹股溝做皮下注射，每點0.2 ml，同時腹腔注射0.2 ml;正常對照組以生理鹽水代替致敏。第15天開始激發，即將大鼠置于特制玻璃容器內(40 cm×30 cm×20 cm)，用超聲霧化器以霧化量0.8 ml/min霧化吸入 1%OVA的生理鹽水，每次20 min，1次/d，連續28 d;正常對照組以生理鹽水代替激發。激發前1 h，各組大鼠按10 ml/kg灌胃給藥，即歸喘寧滴丸高、中、低劑量組灌胃歸喘寧滴丸160、80、40 mg/kg(以當歸揮發油計算)，地塞米松組灌胃地塞米松0.5 mg/kg，正常對照組與模型對照組灌胃空白對照液;1次/d，連續28 d。

1.2.3 支氣管激發實驗 分別于實驗的第28天和第42天進行。用1%OVA激發液霧化吸入(霧化參數與激發相同)20 min，觀察15 min內大鼠的反應并記錄評分，評分原則參照相關文獻進行〔3，4〕，記錄大鼠打噴嚏次數、抓鼻次數與哮喘程度，觀察藥物的平喘作用。具體計分方法是:大鼠沒有出現噴嚏計為0分，出現1～5個噴嚏計為1分，出現6～10個噴嚏計為2分，噴嚏＞11個計為3分;沒有抓鼻計為0分;抓鼻1～5個計為1分，抓鼻6～10個計為2分，抓鼻＞11個計為3分;無喘息癥狀計為0分，有輕度喘息(躁動或靜伏)計為3分，明顯喘息(呼吸困難，腹式呼吸、呼吸急促呈點頭狀但幅度較小、迅速抬頭做喘息狀)計為6分，嚴重喘息(呼吸極度困難，呼吸急促呈點頭狀幅度大頻率高或反應遲鈍)或致死計為9分。

1.2.4 Western印跡法測定肺組織中T-bet與GATA-3的蛋白表達水平 大鼠最后一次激發24 h后，股靜脈采血處死，打開胸腔，于固定位置取未經灌洗的左肺組織100 mg，加入600 μl裂解液，經冰上勻漿、超聲、靜置后4℃離心(15 000 r/min)15 min，取上清液用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白并加入等體積的上樣緩沖液(100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷酸鹽pH值6.8，200 ml/L甘油，0.2 g/L溴酚藍，20 g/L十二烷基硫酸鈉，200 mmol/L二硫蘇糖醇)，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并將蛋白轉移至硝酸纖維膜上，分別與小鼠抗大鼠 T-bet、GATA-3鼠抗體(1∶500)和辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，小鼠抗大鼠β-actin鼠抗體(1∶2 000)和辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG抗體(1∶4 000)同樣室溫溫育2 h。應用發光試劑盒顯示蛋白條帶，將顯帶的X線片經圖像分析系統處理，比較T-bet、GATA-3與β-actin的相對吸光度值，進行半定量分析。

1.2.5 肺組織病理變化 取大鼠未經灌洗的左肺組織，10%甲醛固定，石蠟切片，HE 染色，參考文獻〔3，4〕，在光學顯微鏡下對上皮細胞脫落程度與肺組織炎癥細胞浸潤程度觀察并進行半定量分析。

2 結果

2.1 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠造模過程中行為學的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠在支氣管激發實驗中的行為綜合評分值顯著增加(P＜0.01);與模型對照組比較，歸喘寧滴丸各給藥組大鼠在激發實驗中的行為綜合評分值顯著減小(P＜0.01)。見表1。

2.2 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠肺組織中T-bet和GATA-3蛋白表達水平的影響 經Western印跡法分析顯示，在蛋白質相對分子質量為62 000、50 000和45 000處有表達條帶，分別是T-bet、GATA-3與β-actin蛋白表達。經半定量分析可知，T-bet蛋白在哮喘模型對照組大鼠肺組織中低表達，經歸喘寧滴丸治療后，其表達水平明顯提高(P＜0.01);GATA-3蛋白在模型對照組大鼠肺組織中高表達，經80～160 mg/kg劑量范圍內的歸喘寧滴丸治療后，表達水平顯著降低。見圖1、表2。

2.3 歸喘寧滴丸對實驗性哮喘大鼠肺組織病理改變的影響如圖2所示，正常對照組大鼠肺組織經HE染色后，在顯微鏡下炎癥表現不甚明顯，而模型對照組大鼠肺組織可見明顯的炎癥反應:支氣管上皮細胞腫脹、脫落，基底膜增生、變厚，支氣管壁充血、水腫并有大量嗜酸粒細胞等炎性細胞浸潤;各給藥組亦存在不同程度的上皮細胞脫落、支氣管壁充血、水腫及炎癥細胞浸潤等表現，但較模型對照組明顯減輕。同時，對大鼠支氣管壁上皮細胞脫落程度與炎性細胞浸潤程度進行半定量分析，表3與表4結果顯示，模型對照組與正常對照組比較，大鼠支氣管壁上皮細胞脫落程度與炎性細胞浸潤程度明顯較重(P＜0.01)，各給藥組上皮細胞脫落程度與炎性細胞浸潤程度有不同程度的減輕，平均級數有所下降，其中歸喘寧滴丸高劑量組與模型對照組相比有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠造模過程中行為學的影響(±s)

表1 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠造模過程中行為學的影響(±s)

與模型對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

評分正常對照組 9 2.3±1.82) 9 2.8±0.42)組別 第28天n 評分第42天n模型對照組 9 8.2±2.4 9 9.9±3.0地塞米松組 9 1.9±1.12) 8 1.9±0.42)歸喘寧滴丸高劑分組 9 4.1±1.42) 9 4.3±0.72)歸喘寧滴丸中滴分組 9 4.6±2.12) 8 4.6±1.32)歸喘寧滴丸低劑分組 9 5.1±2.02) 9 5.4±1.02)

圖1 大鼠肺組織T-bet、GATA-3蛋白表達的Western印跡法分析

表2 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠肺組織中T-bet和GATA-3蛋白表達水平的影響(±s)

表2 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠肺組織中T-bet和GATA-3蛋白表達水平的影響(±s)

T-bet GATA-3正常對照組 9 0.698±0.2572) 1.280±0.4022)組別 n模型對照組 9 0.266±0.073 2.891±0.858地塞米松組 8 0.643±0.2292) 1.424±0.3782)歸喘寧滴丸高劑量組 9 0.638±0.2162) 1.457±0.4822)歸喘寧滴丸中劑量組 8 0.532±0.2352) 1.620±0.4952)歸喘寧滴丸低劑量組 9 0.446±0.2021)2.170±0.607

圖2 歸喘寧滴丸對實驗性哮喘大鼠肺臟病理的影響(HE，×20)

表3 歸喘寧滴丸對實驗性哮喘大鼠支氣管壁上皮細胞脫落程度的影響(±s)

表3 歸喘寧滴丸對實驗性哮喘大鼠支氣管壁上皮細胞脫落程度的影響(±s)

組別 n 支氣管壁上皮細胞脫落程度(n)－R值+平均級數(95%可信區間)正常對照組 9 7 2 0 0 0.22 0.09±0.192)模型對照組 9 0 0 5 4 2.44 0.79±0.19地塞米松組 8 0 5 3 0 1.38 0.41±0.201)歸喘寧滴丸高劑量組 9 0 4 5 0 1.56 0.48±0.191)歸喘寧滴丸中劑量組 8 0 3 4 1 1.75 0.54±0.20歸喘寧滴丸低劑量組902432.11 0.66±0.19

表4 歸喘寧滴丸對實驗性哮喘大鼠支氣管壁炎性細胞浸潤程度的影響(±s)

表4 歸喘寧滴丸對實驗性哮喘大鼠支氣管壁炎性細胞浸潤程度的影響(±s)

組別 n 支氣管壁上皮細胞浸潤程度(n)－R值+平均級數(95%可信區間)正常對照組 9 8 1 0 0 0.11 0.07±0.192)模型對照組 9 0 0 6 3 2.33 0.78±0.19地塞米松組 8 0 6 2 0 1.25 0.38±0.201)歸喘寧滴丸高劑量組 9 0 5 4 0 1.44 0.46±0.191)歸喘寧滴丸中劑量組 8 0 3 5 0 1.63 0.53±0.20歸喘寧滴丸低劑量組902522.00 0.66±0.19

3 討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是呼吸系統的常見病、多發病，是一種由T淋巴細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞等多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥性疾病。近20年來盡管已經采取包括吸入糖皮質激素在內的綜合抗炎治療方案，但流行病學調查發現哮喘的發病率、死亡率并沒有隨之而降低〔5〕，仍然迫切需要去尋找新的方法來防治哮喘。當歸是常用中藥之一，傳統理論認為當歸和血、行血、補血，“和血而降氣、暢血而行氣”，“故主咳逆上氣”。當歸主要含有揮發油和水溶性成分，其中揮發油被認為是治療哮喘的主要有效部位，臨床研究顯示，用當歸揮發油丸治療哮喘24例，總有效率可達90.2%〔6〕;以當歸揮發油為主要有效成分的當歸喘痛寧治療喘息型支氣管炎及支氣管哮喘61例，有效率為81.2%〔7〕。豚鼠離體氣管平滑肌實驗顯示，當歸揮發油及其中性非酚性部位能舒張豚鼠離體氣管平滑肌，對抗組胺、乙酰膽堿所致豚鼠離體氣管平滑肌的痙攣性收縮作用〔1〕。在OVA霧化致敏過程中，觀察大鼠打噴嚏、抓鼻甚至哮喘樣癥狀并進行計分，實驗結果顯示歸喘寧滴丸能明顯減小大鼠在激發過程中的行為綜合評分;肺組織病理顯示，歸喘寧滴丸可減輕支氣管上皮細胞脫落、支氣管壁充血水腫及炎癥細胞浸潤等表現，對支氣管壁上皮細胞脫落程度與炎性細胞浸潤程度進行半定量分析，160 mg/kg的歸喘寧滴丸可明顯減輕上述病理指標。

1986年，Mosmann根據分泌細胞因子譜及其功能的不同，將CD4+T細胞分為Th1和Th2兩種亞群，近30年來，該分類方法形成了理解CD4+T免疫作用機制的框架，也形成了哮喘發病的免疫學機制，即以Th2占優勢的Th1與Th2細胞及其相關因子的免疫失衡是哮喘的主要原因〔8〕。T-bet與 GATA-3是Th1與Th2細胞的特異性轉錄因子，在Th細胞的分化中發揮重要調控作用。T-bet是Th1細胞發育的主要開關，通過IFN-γ-STAT1(信號轉導及轉錄活化因子1)信號使其表達增加，活化的T-bet能誘導產生大量IFN-γ等Th1類細胞因子而抑制Th2類細胞因子的產生;GATA-3僅在Th2細胞中表達，通過IL-4/STAT6信號使GATA-3表達增加，活化的GATA-3進入胞核，上調Th2類細胞因子表達，從而促進Th2分化，抑制Th1分化。本實驗結果顯示，歸喘寧滴丸可明顯促進肺組織T-bet蛋白的表達而抑制GATA-3的表達，調節T-bet/GATA-3免疫平衡，這也是歸喘寧滴丸平喘的作用機制之一。

1 吳國泰，任 遠，王 鋒，等.當歸揮發油不同部位對豚鼠離體氣管平滑肌的作用及機制研究〔J〕.甘肅中醫學院學報，2011;28(4):1-4.

2 劉中成，張艷芬.一種大鼠慢性哮喘模型的建立與評價〔J〕.藥效學報，2010;45(6):718-23.

3 劉建文，季 光.藥理實驗方法學〔M〕.北京:化學工業出版社，2003:136-41.

4 王力寧，李志峰，陳平蘭，等.六味地黃顆粒對哮喘大鼠血清NO及肺組織NOS水平影響的研究〔J〕.廣西中醫藥，2011;34(1):47-52.

5 蘇奎國，姜良鐸，郭勇英，等.桑蘇飲對哮喘模型大鼠氣道重塑及肺組織上皮細胞ICAM-1表達的影響〔J〕.山東中醫藥大學學報，2010;34(4):354-7.

6 王鎖才，彭長福，唐敏章，等.當歸揮發油丸對支氣管哮喘止喘作用的臨床觀察〔J〕.天津中醫，1986;(1):4-5.

7 馬 慧，董惠蕓.當歸喘痛寧治療喘息型支氣管炎及支氣管哮喘療效觀察〔J〕.甘肅中醫，1998;11(4):17.

8 陳培麗，王申東，畢銘陽，等.麥芪益肺合劑對哮喘小鼠Th1/Th2平衡的影響及安全性研究〔J〕.中國藥房，2010;21(39):3669-71.