白細胞介素18基因工程表達方法

喬友軍 汪 欣 高 杰 王 寶 賈春祎 (吉林大學第一醫院，吉林 長春 3006)

白細胞介素(IL)-18是一種新型具有多態性的免疫細胞調節因子，以前稱干擾素(IFN)-γ誘導因子〔1〕。IL-18具有抗多種病毒、抗細菌、真菌的功能〔2〕;其對T細胞、B細胞免疫及NK細胞免疫均有相應的生物學作用。IL-18可直接誘導NK細胞和單核細胞分泌 IFN-γ〔3〕，IFN-γ 不抑制 B 細胞的分泌，但可抑制B細胞生成IgE、IgG，對IgG2d高表達〔4〕。IL-18通過增進分泌IL-10，使腫瘤細胞對NK細胞的敏感性增加〔5〕，從而增強對腫瘤細胞的殺傷力。當NK細胞與腫瘤靶細胞結合后開始相互作用，隨即啟動細胞死亡信號，最終細胞DNA的斷裂致使細胞凋亡，起到抗腫瘤的作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑儀器 DNA MARKER:寶生物工程(大連)有限公司;質粒DNA提取試劑盒:天根生化科技有限公司;隔水式恒溫培養箱:GSP-9270型，上海博迅實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 含有pGEX-IL-18重組體質粒的E.coli JM109菌復蘇－80℃冰箱取E.coli JM109菌凍存管1支，立即放入37℃水浴箱中，待完全融化后在生物安全柜內以無菌程序將JM109菌液接種于50 ml LB液體培養基中，37℃，230 r/min振蕩培養18 h，觀察菌液生長情況，供質粒提取使用。

1.2.2 質粒提取 柱平衡后，集菌5 ml，12 000 r/min離心1 min，吸棄上清液。向離心管中加入P1 250 μl，用渦旋振蕩器徹底使細菌沉淀懸浮。向離心管中加入P2 250 μl，顛倒混勻6次。向離心管中加入 P3 350 μl后，顛倒混勻 6次，再12 000 r/min離心10 min后會有沉淀形成。收集上清轉移到吸附柱CP3中，12 000 r/min離心40 s，倒掉廢液。向吸附柱CP3中加入漂洗液PW 600 μl，再12 000 r/min離心40 s，倒掉廢液。先將吸附柱CP3放入收集管中，再12 000 r/min離心2 min。向吸附膜的中間滴加洗脫緩沖液EB 60 μl，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，將質粒溶液收集到離心管中備用。該質粒為pGEX-IL-18，并經過測序和基因庫比對證實。

1.2.3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的質粒 配制1%瓊脂糖凝膠后，放入電泳槽中。將樣品與6×DNA上樣緩沖液混合，并將樣品混合液反復吹打混和均勻，加入到凝膠的加樣孔內，再加入 DNA Marker 2 μl。電泳儀開啟，電壓 100 V，電流90 mA，時間為30 min，最后進行瓊脂糖凝膠電泳。用凝膠成像儀觀察照相。

1.2.4 轉化 將質粒轉化到DH5α細菌內，制備表達IL-18的細胞。組質粒 pGEX-IL-18具備表達 IL-18的功能，轉化到DH5α細菌內，進行增菌培養，即可得到表達的IL-18。

1.2.4.1 受體菌的培養 將甘油貯存的受體菌DH5α在LB平板上劃線，37℃培養20 h。挑取2 mm大小的單菌落接種于1 ml LB液體培養基中，37℃振搖過夜。取上述菌液200 μl轉入50 ml LB液體培養基中，37℃ 300 r/min，振蕩培養2.5 h，使細胞的濃度達5×107個/ml，此時細菌的OD260一般在0.2～0.4之間。

1.2.4.2 感受態細胞的制備 將培養的菌液冰上放置10 min，然后轉移離心管中，4℃ 4 000 r/min離心10 min，棄上清，將離心管倒置于吸水紙上，使剩余的液體流盡。加入10 ml預冷的0.1 mol/L CaCl2使沉淀輕輕懸浮，然后冰浴15 min。此時為感受態細胞。將上述菌液4℃ 4 000 r/min離心10 min，棄上清，每50 ml的原培養物加入2 ml冰預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，再加終濃度為10%的滅菌甘油，按每份200 μl分裝在Ep管中，置－70℃凍貯。

1.2.4.3 質粒轉化到宿主菌細胞內 把感受態細胞各200 μl分別加入實驗管、陽性管、陰性管中;連接產物(100～500)加入實驗管10 μl;已知質粒DNA(10)加入陽性管10 μl;無菌水加入陰性管10 μl后42℃ 90 s后迅速置冰浴3～5 min;再分別在實驗管、陽性管、陰性管中加入SOC培養基各800 μl;37℃振搖培養45～90 min。

1.2.4.4 藍白篩選陽性重組體 取含100 μg/ml氨芐青霉素的LB平板，在板面上涂布IPTG試劑和X-gal試劑。將200 μl上述培養物，以玻璃涂布棒輕輕地平鋪于瓊脂平板表面。將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37℃過夜培養。觀察藍白菌落，白色為陽性重組體。

2 結果

質粒提取瓊脂糖凝膠檢測結果質粒大小為2.7 kb，見圖1。測序結果為IL-18基因片段，見圖2。重組體插入基因片段生物信息比對顯示，插入片段長度和順序與目的基因相符，見圖3。藍白篩選與抗性篩選一同使用，篩選結果:未轉化的菌不具有抗性，不生長;轉化了空載體，即未重組質粒的菌，長成藍色菌落;轉化了重組質粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。

圖1 pGEX-IL-18重組體質粒電泳結果

圖2 IL-18基因片段測序結果

圖3 重組體插入基因片段生物信息比對截圖

3 討論

IL-18是腫瘤免疫學研究的熱點。隨著研究的深入，發現它實為免疫調節因子可殺傷或抑制腫瘤生長并在腫瘤免疫方面發揮了極其重要的作用。很多學者發現腫瘤患者IL-18水平在有轉移患者比無轉移患者和對照組有顯著性增高，從而說明IL-18水平的變化可能反映了人體對腫瘤細胞的防御程度。IL-18對免疫細胞有多項免疫調節功能，這個細胞因子極大潛在的抗腫瘤能力。因此IL-18在腫瘤基因治療方面具有潛在的發展空間，其在基礎領域和應用領域都有了嶄新的發展。如何利用基因工程表達來制備IL-18將是未來的趨勢。

本研究探討了基因工程制備IL-18的實驗條件，為制備IL-18提供實驗保障。下一步工作將是制備純化IL-18的實驗研究，將這個質粒重組體轉移到具有高效表達功能的DH5α宿主菌中進行目的蛋白表達實驗研究，同時探討可通過GST標簽親和層析純化目的蛋白的條件。基于IL-18具有重要抗腫瘤等多種的生物學功能，將對IL-18進行后續的科研工作系統研究。

1 Nakamura K，Okamura H，Nagata K，et al.Purification of a factor which provides a costimulatory signal for gamma int erferon production〔J〕.Infect Immun，1993;61(1):64.

2 Zhang T，Kawakami K，Qureshi MH，et al.Inteleukin-12(IL-12)and IL-18 synergistrically induce the fungicidal activity of murine peritoneal exudate cells against cryptococcus neoformans through production of gamma interferon by natural killer cells〔J〕.Infect Immunol，1997;65(9):3594-9.

3 Greene CM，Meachery G，Taggart C，et al.Role of IL-18 in CD4 T lymphocyte activation in Sarcoidosis〔J〕.J Immunol，2000;165(8):4718-24.

4 Born TL，Morrison LA，Esteban DJ，et al.A poxvirus protein that binds toand inactivates IL-18 and inhibit s NK cell response〔J〕.J Immunol，2000;164(6):3246-54.

5 Cardon GE，Lindemann MJ，Baiocchi R，et al.The functional characterization of interlukin-10 receptor expression on human natural killer cells〔J〕.Blood，1995;8512:3577-85.