間充質干細胞成骨分化過程中長鏈非編碼RNA調控作用研究進展

趙培慶 王連慶 李 濤

山東省淄博市中心醫院中心實驗室，山東淄博255036

間充質干細胞成骨分化過程中長鏈非編碼RNA調控作用研究進展

趙培慶 王連慶 李 濤

山東省淄博市中心醫院中心實驗室，山東淄博255036

間充質干細胞是一類具有自我更新與定向分化的干細胞，在組織修復與細胞生長發育中起重要作用。近期研究發現在間充質干細胞的發育過程中，部分長鏈非編碼RNA表達上調與下調，表明它可能是間充質干細胞發育中的重要調控點，雖然目前該方面的功能性研究比較少，但其強大的研究潛力已經體現。

間充質干細胞；成骨分化；長鏈非編碼RNA

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新與定向分化能力的細胞，1966首次發現時被冠以“成纖維祖細胞”之名，目前已經證實它可以分化成骨骼、軟骨組織、脂肪組織及肌肉等組織，并且在組織修復及細胞生長調節中發揮重要作用［1-2］。研究發現，MSCs通過分泌前列腺素E2（PGE2）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1RA）、白細胞介素-7（IL-7）、白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-11（IL-11）等細胞因子及生長因子來影響免疫微環境，對損傷的組織進行修復［3］。不同于胚胎干細胞，MSCs屬于成體干細胞，因此不具有無限自我更新和永生化能力［4］。基于以上理論基礎，因此其修復調控機制顯得尤為重要。

1 lncRNAs的概念及在干細胞發育分化中的作用

長鏈非編碼RNA（longnoncoding RNAs，lncRNAs）是一類轉錄長度大于200 bp的非編碼RNA，有的甚至超過10 kb，可以形成復雜的空間結構，表明它們參與基因表達調控的分子機制可能更加復雜。根據它們在基因組中的位置可以分為lincRNA、天然反義鏈lncRNA和內含子區lncRNA［5］。目前已經證實它們在轉錄水平及轉錄后修飾水平進行調控，對基因表達調控、腫瘤診斷及闡述其分子機制方面越來越受到人們的重視。近期研究發現，lncRNAs在干細胞多能性及分化等方面起關鍵調控作用，Guttman等［6］通過轉錄測繪技術與染色質免疫共沉淀技術共發現40條與多能干細胞功能相關的lncRNAs，其中有20余條與多能標志物轉錄因子（Nanog，oct4）基因表達相關，表明其在胚胎干細胞分化過程中起重要調控作用。同時，Chakraborty等［7］也鑒定出3條與維持多能干細胞特性的lncRNAs（Panct1-3）。在心肌細胞發育分化過程中，Wamstad等［8］也發現一條在其發育中起重要表觀遺傳調控作用的lncRNA。以上研究結果顯示，lncRNAs在干細胞的生長發育及分化過程中起重要調控作用，研究其調控過程及發現新的長鏈非編碼RNA勢必為干細胞相關研究找到新的途徑和方法。

2 間充質干細胞成骨分化過程中可能的最新調控策略

MSCs作為骨髓成骨細胞前體的重要來源，其分化增殖的時空特異性受到嚴格的調控。一般情況下，骨髓MSCs受遺傳和表觀遺傳機制調控，但具體的分子機制有待闡明，MSCs向成骨細胞分化主要涉及以下幾種信號傳導通路：TGF6信號通路、MAPK通路、Runx/osteorix信號通路、Notch通路、Wnt通路等［9］。國外學者研究發現，如miR-125、miR-141及-200、miR-23等microRNA可通過抑制通路中Runx2蛋白等關鍵分子的表達對MSCs向成骨分化起抑制作用［10-11］；相反，miR-2861、miR-148b等［12-13］可通過激活成骨通路中關鍵分子，對成骨作用起正向調控。這些MSCs成骨調控因子構成一個復雜的調控網絡，對其成骨過程進行精細調節。已有研究證實lncRNAs可作為一種競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與其他RNA轉錄本競爭相同的microRNA，從而抑制microRNA對其靶基因的調控，但其在MSCs成骨作用中調控microRNA的具體機制目前還未見報道。Ye等［14］發現，組蛋白去甲基化酶KDM4B和KDM6B通過消除H3K9me3和H3K27me3甲基化修飾對MSCs成骨分化進行調控，表明通過表觀遺傳學機制，KDM4B和KDM6B可作為治療靶點來控制MSCs分化過程，可為骨質疏松癥等骨代謝疾病治療找到新的線索。近期，研究發現一種轉化生長因子β途徑抑制劑（smallmolecular SB431542）可快速誘導胚胎干細胞產生MSCs［15］，這一發現表明MSCs可通過大量生產應用于臨床治療與修復，但其中的具體調控分子機制目前還不是十分明確。體內炎癥微環境對MSCs的調節也非常重要，微環境中的免疫細胞和炎癥因子可以活化MSCs，誘導其免疫調節功能。最近Dang等［16］學者發現炎癥因子誘導的自噬可以對MSCs免疫功能產生影響，該發現使MSCs的臨床治療產生新的期望。總之，闡明MSCs的調控機制可對臨床治療及其成骨分化調控產生重大影響，lncRNAs作為近期發現的基因“富礦”，雖然在調控MSCs方面報道較少，但它應該在其細胞分化調控中發揮重要作用。

3 lncRNAs對間充質干細胞的調控作用

近年來，隨著高通量測序技術的普及，lncRNAs的重要功能逐漸受到重視，lncRNAs可通過影響基因表達、表觀遺傳學修飾、蛋白質活性調節等方式對生命活動進行調控。

在MSCs向軟骨分化過程中，Wang等［17］發現有3638個lncRNAs有較大程度的變化（2166個表達上調及1472個下調），作者選擇了兩個表達上調的lncRNA ZBED3-AS1和CTA-941F9.9進一步分析驗證，結果表明它們在誘導分化后的第28天仍然持續高表達，提示可能參與了MSCs向軟骨分化的全過程。羅嘉全等［18］利用生物分析軟件分析了在MSCs成骨過程中成骨基因Smurf1、MSX1、BMP1相關的lncRNAs，包括uc003ups、AK096529、AK024937、AKl29811和K056311等。發現大多數lncRNAs在MSCs成骨分化后其表達均較分化前下調，其中3個lncRNAs（AK096529、uc003ups、AK056311）變化有統計學意義。其可能的機制是通過正向調控Smurf1，促使Smurf1表達下調，進而減少Runx2的降解，最終促進MSCs的成骨過程。左長清等［19］用基因芯片技術發現了116個在MSCs成骨過程中差異表達的lncRNAs，細胞實驗進一步證實lncRNA AK089560的表達值在C3H10T1/2細胞成骨分化的第2，4，6天明顯下降，可能的機制是它參與維持MSCs處于未分化狀態；進一步分析發現［20］，116個表達變化的lncRNAs中59個表達上調，57個則是表達下調；其中60.3%是基因間結構區域，另20.7%是位于編碼區域；且24個lncRNAs都能找到相應的毗鄰編碼基因所匹配，提示它們可能是lncRNAs的調控目標基因。例如EGFR是成骨促進因子Runx2和Osterix的抑制物，小鼠lincRNA0231可通過調控表皮生長因子受體信號通路來負向影響成骨過程；lncRNA NR_027652則通過影響DLK1、lincRNA0243通過影響IL-5參與了MSCs的成骨過程。程晨等［21］發現在MSCs成骨過程中表達明顯下調的lncRNAs有24條，細胞實驗進一步證實其中AK035085可能通過對成骨過程中關鍵基因抑制來起作用。Wang等［22］同樣用芯片技術發現了一些在成骨分化過程中的重要lncRNAs，最終證實lncRNA H19和uc022axw.1的表達上調可能參與了MSCs成骨分化的過程。Zhu等［23］報道，lncRNA-ANCR可以維持成骨細胞的非分化狀態，其分子機制主要是通過與EZH2作用來抑制Runx2蛋白的表達，從而導致成骨分化降低；相反，下調lncRNAANCR則可促進成骨分化。

MSCs在不同的解剖區域有不同的生物學活性，Dong等［24］據此通過芯片分析了骨髓中MSCs和牙周韌帶干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）中的lncRNAs表達差異情況，發現了457個表達上調及513個表達下調的lncRNAs。某些lncRNAs在PDLSCs中高表達，如NR 045555、NR 033651和NR 027621；另外一些則相比骨髓MSCs低表達，如NR 037182、NR 037595和XR 111050。作者還同時檢測了相關的mRNA表達情況，并用生物信息學技術構建起一個lncRNAs-mRNA模型，分析發現，這些lncRNAs可能通過影響相關mRNA的轉錄水平進而影響了諸如凋亡、MAPK、Wnt等復雜的信號通路，最終影響到細胞的凋亡、增殖與分化過程，它們很可能也參與了MSCs的成骨分化進程。

有報道稱MSCs細胞有致瘤傾向，Shoshani等［25］發現lncRNA H19高表達，則這種傾向更明顯，表明lncRNA H19可能在其成瘤分化中起到正向調控作用，它也可以成為MSCs致瘤過程中的一個潛在治療靶點；Liu等［26］的研究成果表明lncRNA HOTAIR也參與了表皮-間質的轉化過程。在骨髓瘤細胞向MSCs轉化過程中，lncRNA MALAT1可通過影響LTBP3基因表達參與了整個轉化過程［27］。這些研究一定程度上拓展了人們對lncRNAs在MSCs生物學功能影響方面新的認識。

4 小結與展望

基因的經典功能是編碼對細胞生命活動至關重要的蛋白質，但是占基因絕大部分的非蛋白編碼序列則是由包括micro RNAs、lncRNAs等在內的調控序列組成。隨著二代測序技術和生物信息學技術的不斷成熟，大量的lncRNAs被發掘出來，初期的研究成果已經表明，lncRNAs參與了細胞分化、個體發育等重要生命活動的整個調控過程，并與人類的諸多重大疾病密切相關。DNA元件百科全書（encyclopedia ofDNA elements，ENCODE）計劃已經在人類基因組中鑒定了9000余條lncRNAs，但其中具有明確生物學功能的僅有100條左右［28］，大量的基因“富礦”有待人類去開發。

相比其他細胞功能研究，lncRNAs在MSCs中的功能研究少之又少。但毋庸置疑，雖然前期研究僅停留在生物芯片與生物信息學分析層面，其強大的研究潛力已經呈現出來。基于lncRNAs在生命領域的強大功能，隨著新的研究技術體系的建立，lncRNAs在調控間充質干細胞分化、增殖、凋亡等重要生命活動中的確切分子機制最終將得以闡釋。

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Progress on the regulate process of long non-coding RNA in osteogenic differentiation ofmesenchymal stem cell

ZHAO Peiqing WANG Lianqing LITao
Department of Central Laboratory,Zibo Central Hospital,Shandong Province,Zibo 255036,China

Mesenchymal stem cell,one type of self-renewal and directed differentiation of stem cells,plays important roles in the tissue repair and cell growth.Recently,researchers have found thatmany long non-coding RNAs up and down regulated in the process ofmesenchymal stem cell development,which means it as an important regulatory point may plays important functions in the development ofmesenchymal stem cell.Although the researches are little focused on the functional studies,its potential prospect has been valued.

Mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;Long non-coding RNA

R34

A[文獻標識碼]1673-7210（2015）06（c）-0035-04

2015-03-31本文編輯：蘇暢）

山東省自然科學基金（ZR2014HM042）。

趙培慶（1977.3-），男，碩士；研究方向：骨質疏松相關免疫機制。

李濤（1970.6-），男，博士，主任醫師，碩士研究生導師；研究方向：骨質疏松與骨礦鹽代謝。