多菌靈降解菌的鑒定及降解條件初步優化

徐惠娟　胡典典　張虹

摘要：對已分離到的多菌靈降解菌進行16S rDNA序列分析后，采用均勻設計法，優化多菌靈降解菌降解條件。用4因素6水平混合均勻設計表，綜合考察培養時間、接種量、pH、溫度對多菌靈降解菌降解能力的影響。通過二次多項式逐步回歸得出最終降解條件為：培養時間6 d、接種量10%、pH 4.0、溫度為45 ℃時，最優目標函數Y（降解率）為68.65%。進一步進行盆栽試驗，檢測該菌在實際應用中的降解效率為59.54%。

關鍵詞：多菌靈降解菌；均勻設計；降解條件優化；盆栽試驗

中圖分類號：Q939.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2372-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.016

多菌靈是一種高效廣譜低毒的內吸性殺菌劑，廣泛應用于工業和農業生產，主要用于水果保鮮、蔬菜、果樹和谷類作物的真菌病害防治[1]。多菌靈化學性質穩定且降解半衰期長，在果蔬及土壤中的殘留能對生態環境和人、畜健康造成極大危害[2]。利用生物降解法去除多菌靈殘留已成為熱點。本研究運用均勻試驗設計的方法，多因素多水平地優化多菌靈降解菌對多菌靈的降解條件，評估降解菌的降解能力，為實現多菌靈殘留去除的生物修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株從長期噴灑多菌靈的花卉基質土中分離純化得到，保存于實驗室內。

1.2 試劑與培養基

多菌靈標準品由Adamas公司生產，純度為98%，80%多菌靈懸浮劑為蘇州遍凈植保科技有限公司生產。

種子培養基參考文獻[3]，降解培養基為NaCl 100 mg，K2HPO4 150 mg，KH2PO4 50 mg，MgSO4·7H2O 20 mg，（NH4）2SO4 200 mg，多菌靈20 mg，去離子水 100 mL。pH依需要調節。

1.3 菌株鑒定

將菌株充分活化后進行菌體形態觀察和革蘭氏染色。提取細菌基因組DNA，PCR擴增16S rDNA，PCR產物純化后送上海生工生物工程有限公司測序，測序數據在NCBI上進行BLAST比對分析。

1.4 均勻設計及數據分析

選用均勻設計試驗方案，擬選4因素，即培養時間（X1）、接種量（X2）、pH（X3）、溫度（X4）（圖1），每個處理重復5次，測定不同因素條件下多菌靈降解菌對多菌靈的降解能力，采用DPS數據處理系統分析所得數據，對多菌靈降解率進行優化求解，建立菌株對多菌靈的最佳降解力模型，預測最佳值。

1.5 盆栽試驗

1.5.1 小白菜的預處理 種植7盆小白菜，其中試驗組3盆，對照組4盆。按市售多菌靈使用說明配制多菌靈懸浮劑，將所配藥劑等份均勻噴灑到試驗組與對照組的小白菜莖及葉表面，早晚各處理一次，每次每盆20 mL。連續處理2 d，第3天開始用生長于對數期的菌液處理小白菜，每盆菌液20 mL，對照不噴菌。噴菌后第3、5、7天采樣進行多菌靈殘留測定。

1.5.2 標準曲線的繪制與樣品的提取分離 參考于彥彬等[4]測量多菌靈殘留量的方法，進行標準曲線的繪制和樣品多菌靈殘留量測定。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

在牛肉膏蛋白胨平板培養基上進行菌株djj-1活化培養24 h后觀察，菌落較小，奶白色，表面光滑，濕潤，呈圓形。顯微鏡下觀察菌體為桿狀，單個存在或成對存在，靜止期呈球形，革蘭氏染色為革蘭氏陰性菌。

將菌株djj-1的16S rDNA序列在NCBI上進行序列比對分析和同源性比較，發現其與Acinetobacter baumannii的同源性達99%。

2.2 降解菌的降解條件優化

采用三波長校正法對均勻設計的每個試驗處理進行多菌靈降解率的測定，結果見圖1。

采用偏最小二乘回歸法（Partial Least Squares，PLS）[5]，以培養時間（X1）、接種量（X2）、pH（X3）、溫度（X4）為自變量；以降解率（Y）為因變量建立回歸方程如下：

Y=56.298 4-1.150 6X1-7.162 0X2+1.567 2X3-0.055 1X4-0.416 1X12+0.202 8X22+0.005 1X33- 0.003 7X44+0.5352 7X1X2+0.238 4X1X3+0.002 7X1X4-0.243 6X2X3+0.156 4X2X4-0.056 0X3X4

回歸方程Y的決定系數R2為0.865 3，經F檢驗P<0.01，表明回歸方程的擬合程度較好。

為了尋求在試驗條件下獲得最大降解率，通過DPS數據處理系統對回歸方程Y進行優化求解，得到各個試驗因素的最優組合：X1為6，X2為10，X3為4，X4為45，即培養時間為6 d、接種量為10%、pH 4.0、溫度45 ℃時，最優目標函數Y（降解率）為68.65%。

2.3 多菌靈降解菌株的初步應用分析

2.3.1 標準曲線 參照多菌靈標準曲線[4，6]的測定步驟， 測定不同含量多菌靈的三波長校正吸光度ΔA， 以校正吸光度ΔA為縱坐標，多菌靈的含量為橫坐標，繪制標準曲線。在0～50 μg濃度范圍內，曲線的回歸方程為Y= 0.001 5-0.000 8X（μg），Y為校正吸光度ΔA，相關系數為0.999 5。

2.3.2 樣品的測定結果 對處理后的小白菜進行多菌靈殘留量的測定，根據數據計算得最大降解率為59.54%（表2），在理想最優目標函數（降解率）68.65%以內。

3 小結與討論

微生物法是消除環境中多菌靈農藥污染的有效手段，因此，選育和應用高效多菌靈降解菌是多菌靈環境污染實現高效處理的重要措施。本研究將多菌靈降解菌經多次分離純化后，對其進行16S rDNA序列分析，發現與Acinetobacter baumannii的同源性達99%。

菌株對多菌靈的降解容易受到多種因素的限制，包括多菌靈的濃度、培養時間、pH、溫度及金屬離子等。目前對多菌靈降解菌的研究多局限在實驗室試驗單因素水平降解率方面，本研究應用均勻試驗設計方法，從多因素、多水平研究微生物降解多菌靈的能力，優化菌株djj-1對多菌靈的降解條件。結果表明，在其最優條件下，即培養時間6 d、接種量為10%、pH 4.0、溫度45 ℃時，降解率為68.65%。

本試驗采用分光光度法進行了小白菜中多菌靈殘留量的測定。結果表明，多菌靈菌株對小白菜中多菌靈最大降解率為59.54%，其結果較為滿意，但本試驗只是研究了菌株對盆栽小白菜多菌靈的降解作用，實驗室中的溫度相對適中，晝夜溫差不大，無陽光暴曬等環境因素的影響。如果將降解菌在戶外蔬菜田中應用，對多菌靈的降解能力如何尚有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 馮 堅.英漢農藥名稱對照[M].北京：化學工業出版社，2003.

[2] GARCIA P C， RUIZ J M， RIVERO R M， et al. Is the application of carbendazim harmful to healthy plants evidence of weak phytotoxicity in tobacco[J]. J Agric Food Chem，2002，50（2）：279-283.

[3] 沈 萍.微生物學實驗[M].第四版.北京：高等教育出版社，2007.

[4] 于彥彬，苗在京，萬述偉，等.三波長校正光度法測定水果蔬菜中多菌靈殘留量[J].理化檢驗（化學分冊），2005（5）：353-357.

[5] 蔣衛紅，夏結來.偏最小二乘回歸及其應用[J].第四軍醫大學學報，2003，21（3）：2802-2831.

[6] 范寧云，蔡 興，李彩霞.分光光度法測定蔬菜中多菌靈殘留量新方法的研究[J].甘肅科技，2009，25（2）：52-53.