山銀花多糖提取工藝參數優化

楊申明　王振吉　謝啟明

摘要：采用苯酚-硫酸法測定山銀花（Lonicera hypoglauca）多糖的含量，并對提取工藝進行優化。在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗，以山銀花多糖提取率為指標，探討了提取次數、提取溫度、提取時間、料液比對山銀花多糖提取率的影響。結果表明，最佳提取工藝參數為提取4次、提取溫度80 ℃、提取時間150 min、料液比1∶20（g∶mL）。在此條件下，山銀花中多糖平均提取率為15.39%，加樣回收率為97.70%，該方法提取山銀花多糖操作簡便、準確度高、重現性好，可作為山銀花多糖提取和含量測定的方法。

關鍵詞：山銀花（Lonicera hypoglauca）；多糖；苯酚-硫酸法；正交試驗

中圖分類號：S567.1+9；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2466-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.043

山銀花（Lonicera hypoglauca）別名大銀花、金因花（哈尼族名）、棒早瓜（苗族名），為忍冬科菰腺忍冬干燥的花蕾或帶初開的花[1]。它味甘、性寒，是臨床中常用中藥，藥用價值很高，具有清熱解毒、疏散風熱的功效，常用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫熱發病等。山銀花在中國資源豐富，分布于全國各省，它具有抗病原微生物、抗炎、抗氧化、保肝、抗腫瘤、免疫調節與抗動脈粥樣硬化等方面的活性，在民間使用較為廣泛，是多種中成藥的主要原料。近年來，山銀花還被廣泛應用于食品、飲料、保健品、化妝品和獸醫用等方面。據文獻報道，山銀花的化學成分主要有揮發油類、黃酮類、有機酸類和苷類等[2]。

多糖（Polysaccharide）是由許多相同或不同的單糖以糖苷鍵聚合而成的高分子化合物，它是自然界中儲量豐富的生物聚合物，主要包括植物多糖、動物多糖以及微生物多糖3類[3]。植物多糖具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗衰老、抗疲勞以及抗凝血、抗炎、抗菌、抗驚厥、鎮靜、止喘及降血壓等[4-8]多種生物活性及藥理作用，很可能是山銀花免疫調節和抗癌抗腫瘤的有效成分之一。目前，有關山銀花多糖含量測定及提取工藝研究尚未見報道。試驗采用水提醇沉法對山銀花中多糖進行提取，通過有關顯色反應對提取物進行定性鑒定，用苯酚-硫酸法測定其多糖含量，通過正交試驗對提取工藝進行了優化，旨在為山銀花的藥學價值研究提供參考并為其進一步開發利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山銀花采自云南省雙柏縣衰牢山，經鑒定為忍冬科植物；葡萄糖標準品（≥98%）、石油醚（沸程30～60 ℃）、三氯乙酸、95%乙醇、苯酚、蒽酮、α-萘酚、濃硫酸等均為分析純。

722S型分光光度計（上海青華科技儀器有限公司）、HH-S2s型恒溫水浴鍋（金壇市大地自動化儀器廠）、電子天平（奧豪斯儀器）、12B5型臺秤（成都天平儀器廠）、SHZ-ⅢA型循環水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）、遠紅外快速恒溫干燥箱（鄄城威瑞科教儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料處理 樣品依次用自來水、去離子水洗凈風干后放入遠紅外快速恒溫（55 ℃）干燥箱中烘干，粉碎后過40目篩，得山銀花干粉。將山銀花干粉用折疊成筒狀的濾紙裝好置于索式提取器中，加入石油醚冷浸48 h，然后置于75 ℃水浴中，使其微沸回流反復提取，直至提取液澄清為止，取出冷卻至室溫。用減壓抽濾，濾渣用石油醚充分洗滌后，風干至石油醚全部揮發，得到去除色素和油脂的山銀花，烘干后密封保存，備用。

1.2.2 山銀花多糖的提取 準確稱取去除色素和油脂的山銀花干粉5.00 g，置于250 mL燒杯中，加入125 mL去離子水，置于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱120 min后。減壓抽濾，濃縮濾液，往濾液中加入等體積的3%三氯乙酸除去山銀花中的蛋白質，搖勻、靜置過夜，離心除去沉淀，再往濾液中加入4倍體積的95%乙醇沉淀多糖，靜置24 h，將醇沉后的白色絮狀物進行離心，得山銀花多糖粗提物，用去離子水溶解多糖粗提物，得供試品溶液，備用。

1.2.3 山銀花多糖的鑒定 取2 mL供試品溶液3份，分別加質量分數為5%苯酚溶液1 mL和硫酸溶液2 mL，濃度為2 g/mL蒽酮-硫酸溶液4 mL，質量分數為0.5% α-萘酚溶液1 mL和濃硫酸溶液2 mL，進行顯色反應，觀察試驗現象，檢驗有無多糖[9，10]。

1.2.4 山銀花多糖含量測定

1）葡萄糖標準溶液的制備。準確稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖標準品100.00 mg，用去離子水溶解搖勻，并定容至100 mL容量瓶中，得濃度為1.00 mg/mL的葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別置于7個100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，再從上述容量瓶中分別移取4.0 mL溶液放入比色管中，再分別加入5%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，置于35 ℃恒溫水浴鍋中加熱40 min，冷卻至室溫，以去離子水作空白對照，在490 nm波長處測吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖標準溶液濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，建立回歸方程[11]。

2）多糖提取率的計算。將所得山銀花多糖全部轉移至100 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，再從100 mL容量瓶中移取1.0 mL溶液，置于100 mL容量瓶，加入去離子水定容，混均，再吸取4.0 mL已混勻的溶液，按標準曲線繪制方法測其吸光度。將所得吸光度代入線性回歸方程得到樣品稀釋后的濃度，將其值代入下式方程即可以求出多糖提取率：

多糖提取率=樣品溶液濃度×稀釋倍數×總體積/樣品質量×100%

1.2.5 單因素試驗 按照上述提取方法，分別考察以下單因素的影響[12-14]：提取次數（1、2、3、4、5）、提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）、提取時間（60、90、120、150、180 min）、料液比（g∶mL，下同）（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）。

1.2.6 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，選擇提取次數、提取溫度、提取時間、料液比為試驗因素，每個因素取3個水平，以多糖提取率為評價指標，設計L9（34）正交試驗研究最佳工藝條件。因素與水平見表1。根據正交試驗的結果，在最佳提取工藝參數條件下測定山銀花的精密度和加標回收率。

2 結果與分析

2.1 多糖的定性鑒定

顯色反應結果見表2。由表2可知，山銀花中含有多糖類化合物。

2.2 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖1。由圖1可知，葡萄糖濃度在0.0～35.0 μg/mL內線性關系良好，其回歸線方程為A=0.001 08+0.013 24C，R=0.999 78。

2.3 單因素試驗結果

提取次數對多糖提取率的影響見圖2a。由圖2a可知，開始時隨提取次數的增多，多糖的提取率增大，當提取次數達3以后，多糖提取率變化不大，故試驗選擇提次數為2～4用于下一步優化試驗。提取溫度對多糖提取率的影響見圖2b。由圖2b可知，開始時隨著提取溫度的升高，多糖的提取率升高，當提取溫度升高到80 ℃時，提取率最高，之后隨提取溫度的增加，多糖提取率呈下降趨勢，故選擇提取溫度為70～90 ℃用于下一步優化試驗。提取時間對多糖提取率的影響見圖2c。由圖2c可知，開始時隨著提取時間的延長，多糖的提取率升高，當提取時間延長到120 min時，提取率最高，之后隨提取時間的延長，多糖提取率呈下降趨勢，故選擇提取時間為90～150 min用于下一步優化試驗。料液比對多糖提取率的影響見圖2d。由圖2d可知，開始時隨溶劑的增加，多糖提取率升高，當料液比為1∶25時提取率最高，之后隨著溶劑的進一步的增加，多糖提取率呈下降趨勢，故選擇料液比為1∶20～1∶30用于下一步優化試驗。

2.4 正交試驗結果

正交試驗結果見表3。由表3可知，各因素對山銀花多糖提取率的影響主次順序為：A>B>D>C，即提取次數>提取溫度>料液比>提取時間，最佳組合為A3B2C3D1，最佳提取工藝參數為提取4次、提取溫度80 ℃、提取時間150 min、料液比1∶20。在此條件下進行重復性試驗，測得山銀花中多糖平均提取率為15.39%，RSD為0.27%（n=5），表明該方法重現性好。加標回收率為97.70%，RSD為1.42%，表明該方法對山銀花多糖提取測量的準確度較高。

3 小結與討論

由熱水法提取得到的粗多糖中常含有蛋白質，常用的去蛋白質方法有Sevag法、三氯乙酸沉淀法和蛋白酶水解法、鞣酸法等，本試驗采用三氯乙酸沉淀法去除山銀花多糖中的蛋白質。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，為避免苯酚氧化，苯酚試劑要現用現配，由于硫酸密度比水大，容易分層，因此樣品加入苯酚試劑后和紫外測定前一定要振搖充分。

本研究結果表明，山銀花中富含多糖化合物，各因素對山銀花多糖提取率的影響程度不同，在趨于提取平衡的條件下，其影響的主次順序為提取次數>提取溫度>料液比>提取時間。優化后的最佳提取工藝參數為提取4次、提取溫度80 ℃、提取時間150 min、料液比1∶20，在此條件下測得山銀花多糖平均提取率為15.39%，RSD為0.27%（n=5），加標回收率為97.70%，該方法測定山銀花多糖含量，可獲得良好的線性關系（R=0.999 78），而且重現性試驗、回收率試驗均符合分析要求，方法準確，可用于山銀花中多糖的提取和含量測定。

目前，對山銀花化學成分與藥理作用等方面研究相對較少，并且主要集中在綠原酸的研究方面， 對山銀花的其他活性成分及其藥理作用機理、臨床應用等有待進一步的研究探索。本試驗首次對山銀花多糖的測定方法和提取工藝參數進行了初步研究，但山銀花多糖的組成、結構、藥理藥效作用還需要更進一步的研究。

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