毛細管電泳法對不同年齡牦牛肉中的肌苷酸含量的分析

任亮 于淼 黃林 王鵬非 金素鈺 鄭玉才

摘要：采用毛細管電泳（CE）測定不同年齡的九龍牦牛背最長肌中肌苷酸（IMP）含量，以闡明九龍牦牛肉中IMP隨年齡的變化規律。高氯酸法提取3歲、5歲和7歲公牦牛以及12歲母牦牛背最長肌中的IMP，然后用CE測定。結果表明，樣品中IMP能在15 min內獲得有效分離，且線性關系良好。3歲公牦牛背最長肌中IMP含量（1.46±0.14） mg/g分別極顯著和顯著高于5歲、7歲的公牦牛；12歲母牦牛背最長肌中IMP含量（1.18±0.36） mg/g顯著低于3歲公牦牛（P<0.05），與5歲、7歲的公牦牛相比差異不顯著。牦牛背最長肌中IMP含量與年齡有關，并為確定九龍牦牛肉最佳屠宰年齡提供了一定的依據。

關鍵詞：牦牛肉；毛細管電泳；肌苷酸

中圖分類號：TS251.5+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2480-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.047

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有牛種，其肉具有高蛋白、低脂肪、風味獨特等特點，屬于優質綠色肉類資源。肌苷酸（IMP）又名次黃嘌呤核苷酸，是肉中重要的鮮味物質之一。準確測定牦牛肉中的IMP含量對于了解牦牛肉的風味具有實際價值。目前，測定肉中肌苷酸主要采用高效液相色譜法（HPLC）[1]。毛細管電泳（CE）是近幾十年發展起來的新分析方法，具有快速、靈敏、自動化程度高等優點，較之HPLC操作步驟更簡單，成本更低。目前，國內外已有CE分析核苷酸的報道[2，3]。CE分析核苷酸含量容易受pH、緩沖液濃度等因素的影響。本研究建立并優化了CE分析牦牛肌肉中IMP含量的方法，通過檢測不同年齡九龍牦牛背最長肌中IMP含量，闡明九龍牦牛肉中IMP隨年齡變化的規律，為確定九龍牦牛產肉的最佳屠宰年齡提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇四川省甘孜州天然放牧的3歲、5歲和7歲九龍牦牛公牛，以及12歲九龍牦牛母牛各8頭，屠宰時采集背最長肌，-80 ℃保存待用。

肌苷酸標準品（美國Sigma公司）；磷酸二氫鉀（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；四硼酸鈉（分析純，西安化學試劑廠）。

1.2 儀器

P/ACE MDQ毛細管電泳儀（美國Beckman公司），配有二極管陣列檢測器；Z323K高速冷凍離心機（德國HermLe公司）；DELEA 320 pH計（瑞士METTLER TOLEDO公司）；SB-5200DTD超聲波清洗機（寧波新芝科器研究所）；WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠） ；WPA Biowave II 分光光度計（英國Biochrom公司）；OMNI-GLH電動勻漿器（美國OMNI公司）。

1.3 方法

1.3.1 前處理 采用高氯酸法[1]，準確稱取0.100 g背最長肌，加入0.6 mol/L高氯酸2 mL，用電動勻漿器勻漿2次，每次15 s，冰上放置5 min后以12 000 r/min離心5 min。取上清液1 mL，加入423 μL的1 mol/L KOH溶液，混合后以10 000 r/min于4 ℃離心10 min。上清液用0.45 μm水性膜過濾，4 ℃保存備用。1.3.2 標準品的配制 稱取肌苷酸0.010 0 g溶于10 mL去離子水中，滴入少許1 mol/L KOH溶液助溶，其準確濃度采用分光光度法測定[4]。采用pH 5.5（磷酸調節）緩沖液稀釋標準溶液至10～160 μg/mL系列梯度，并用0.45 μm水性膜過濾，待測。

1.3.3 分析條件 電泳條件主要參照文獻[5]，并做部分調整[6-9]：毛細管柱為Beckman非涂層毛細管（57 cm×50 cm，75 μm）。緩沖液為50 mmol/L KH2PO4與50 mmol/L Na2B4O7等體積混勻，磷酸調節至pH 6.5，0.45 μm水性膜過濾，4 ℃保存備用。使用前超聲脫氣10 min。參數設定：柱溫25 ℃，檢測波長249 nm。毛細管在每次進樣前分別用0.1 mol/L的NaOH和去離子水沖洗5 min，再用運行緩沖液沖洗10 min，檢測完成后再用去離子水沖洗10 min，組分定性參照標準品的保留時間。

1.3.4 精密度檢驗 將同一樣品連續進樣6次，計算保留時間與峰面積的相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 肌苷酸（IMP）標準品的毛細管電泳分析

標準品IMP的保留時間約為13 min（圖1），峰形良好，峰面積與標準品濃度之間具有較好的線性關系，標準曲線方程為y=1 227.9x-2 136.5，在10～160 μg/ mL范圍內R2為 0.997 6；最小檢出限（S/N=3）為1 μg/mL；分析方法具有良好的精密度，IMP保留時間RSD為1.3%，峰面積RSD為2.4%。

2.2 牦牛背最長肌中IMP含量

樣品的色譜圖見圖2，色譜峰對稱性好。分析表明，3歲公牦牛背最長肌中IMP含量分別極顯著和顯著高于5歲、7歲的公牦牛，而5歲與7歲牦牛背最長肌中IMP的含量差異不顯著（表1）；12歲母牦牛背最長肌中IMP含量為（1.18±0.36） mg/g，顯著低于3歲公牦牛（P<0.05），與5、7歲的公牦牛相比差異不顯著。

3 小結與討論

試驗結果中不同年齡公牦牛背最長肌中IMP含量（表1）均低于魏雅萍等[10]、付永等[11]用HPLC測定的1.5歲公牦牛肋骨間最長?。↙D）中IMP的含量分別為2.06 mg/g和2.38 mg/g。有研究報道，海門公山羊同一個體中不同部位的肌肉中IMP含量差異不顯著[12]。因此，牦牛肉中肌苷酸含量的差異可能主要源于試驗牦牛的年齡不同[13]。另外，本試驗發現相同飼養條件下，3歲公牦牛背最長肌中IMP含量（1.46 mg/g）極顯著高于5歲公牦牛（1.03 mg/g），說明牦牛背最長肌中IMP含量與年齡有關。由于動物肌肉中IMP含量還受飼養條件、營養和品種等多種因素的影響[13-16]，因此，牦牛肉中肌苷酸含量還可能受到牧草的季節性變化等因素的影響。本研究中12歲母牦牛背最長肌中IMP含量與5歲和7歲公牦牛接近，提示在該年齡階段，母牦牛肉仍保持較好的鮮味。馬旺等[6]、趙國芬等[17]測定了不同畜禽肌肉中的肌苷酸含量，豬肉（1.55 mg/g）、牛肉（1.2 mg/g）、雞肉（1.81 mg/g）、鴨肉（1.26 mg/g）、山羊（1.74 mg/g）。同各畜禽相比，3歲九龍牦牛肉中IMP含量（表1）高于鴨肉和普通牛肉，而5歲九龍牦牛肉中IMP含量（表1）低于其他肉類。因此，就IMP對肉鮮味的貢獻而言，九龍牦牛肉與普通牛肉大致相當。

本試驗采用HPLC法的肌肉樣品前處理技術，通過優化CE分析條件，建立了牦牛肉中IMP方法的CE分析方法。由于CE法中的毛細管成本低于HPLC色譜柱，且進樣量少、操作簡單，結果重現性好，線性范圍廣，表明該方法具有具有較大的應用潛力。試驗發現，牦牛背最長肌中IMP含量與其年齡有關，該結果可對牦牛最佳屠宰年齡提供參考。

參考文獻：

[1] 王翠麗，王 永，鄭玉才，等.山羊、藏系綿羊和黃牛肉中肌苷酸含量的比較[J]. 湖北農業科學，2010，49（11）：2859-2863.

[2] SHAO X，O'NEILL K，ZHAO Z，et al. Analysis of nucleotide pools in human lymphoma cells by capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A，1994，680（2）：463-468.

[3] 杜建中，曾秀文，黃少春，等.毛細管電泳法測定增味劑中的5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的含量[J].食品工業科技，2010， 31（12）：335-337.

[4] GILL B D，INDYK H E. Development and application of a liquid chromatographic method for analysis of nucleotides in milk and infant formulas[J]. IntDairy J， 2007，17（6）：596-605.

[5] UHROV？魣 M，DEYL Z，SUCH？魣NEK M. Separation of commom nucleotides， mono-，di- and triphosphates，by capillary electrophoresis[J].J Chromatogr B，1996，681（1）：99-105.

[6] 馬 旺，蔡海瑩，譚華榮，等.畜禽肌肉中肌苷酸測定的高效毛細管電泳法研究[J].食品科學，2009，30（6）：180-183.

[7] SUSAN E，GELDART，PHYLLIS R，BROWN.Analysis of nucleotides by capillary electrophoresis[J]. J Chromatogram A，1998，828（1-2）：317-336.

[8] YEH C F，JIANG S J.Determination of monophosphate nucleotides by capillary electrophoresis inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Analyst，2002，127（10）：1324-1327.

[9] LIU C C，HUANG J S，TYRRELL D L，et al. Capillary electrophoresis-electrospray-mass spectrometry of nucleosides and nucleotides： Application to phosphorylation studies of anti-human immunodeficiency virus nucleosides in a human hepatoma cell line[J]. Electrophoresis，2005，26（7-8）：1424-1431.

[10] 魏雅萍，丁鳳煥，徐驚濤，等.牦牛、犏牛及黃牛肉脂肪酸和風味物質的分析[J].青海畜牧獸醫雜志，2009，39（5）：1-4.

[11] 付 永，魏雅平，孟 茹.牦牛、犏牛和黃牛生產性能、肉營養品質及風味物質的比較[J].動物營養學報，2013，25（11）：2734-2740.

[12] 謝愷舟，陳書琴，李洋靜，等.海門山羊羊肉中肌苷酸與肌內脂肪沉積規律的研究[J].遺傳育種，2011，47（23）：18-21.

[13] 周小娟，朱年華，張日俊.品種、日齡及飼養方式對肌肉肌苷酸和肌內脂肪含量的影響[J].動物營養學報，2010，22（5）：1251-1256.

[14] 李慧芳，陳寬維.不同雞種肌肉肌苷酸和脂肪酸含量的比較[J].揚州大學學報，2004，25（3）：9-11.

[15] 方 燕，過世東.棚養和塘養甲魚肌肉中呈味核苷酸的含量變化及比較[J].食品研究與開發，2006，27（8）：17-22.

[16] 陳 寧，尹君亮，李國慶，等.不同營養調控劑對牛肉中肌苷和肌苷酸含量的影響[J].家畜生態學報，2009，30（1）：65-67.

[17] 趙國芬，敖長金，趙志恭，等.沙蔥和油籽對羊肉肌苷酸和腺苷酸含量的影響[J].華北農學報，2007，22（1）：164-166.