紫元膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王銀娟等

[摘要] 目的 建立紫元膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 對(duì)處方中枸杞子、山藥、茯苓進(jìn)行顯微鑒別；采用薄層色譜法對(duì)紫河車和枸杞子進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中甜菜堿的含量。色譜柱為Zorbax-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%四氫呋喃（85∶15），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為192 nm，柱溫為25℃。 結(jié)果 顯微鑒別特征明顯易察見，重現(xiàn)性佳；薄層色譜鑒別結(jié)果斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾；高效液相色譜法中，甜菜堿濃度在0.02922～0.46752 mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=1.0，平均回收率為101.44%，RSD為1.85%（n = 9）。 結(jié)論 建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可靠、準(zhǔn)確，可用于紫元膠囊的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 紫元膠囊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；顯微鑒別；薄層色譜法；高效液相色譜法；甜菜堿

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）06（c）-0089-04

紫元膠囊為南京軍區(qū)南京總醫(yī)院的自制制劑，由紫河車、枸杞子、山藥、茯苓4味藥組成，具有益氣養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎的功效。用于體質(zhì)虛弱、氣血不足、反復(fù)感冒、小兒生長發(fā)育遲緩、子宮發(fā)育不良、不孕癥等。臨床應(yīng)用多年療效確切，深受廣大患者歡迎。為有效控制制劑質(zhì)量，確保用藥安全有效，筆者建立了山藥、枸杞、茯苓的顯微鑒別方法[1-2]，紫河車、枸杞子的薄層色譜鑒別方法[3]，對(duì)枸杞子、甜菜堿采用了高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，為制訂制劑完整的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀（四元泵、DAD檢測(cè)器）；OLYMPUSCX-31系統(tǒng)顯微鏡（奧林巴斯）；WHF-203B三用紫外分析儀（上海禾汽）；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；AE240電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；FA1604S電子天平（上海天平儀器廠）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

紫河車對(duì)照藥材（批號(hào)：121576-201001）、枸杞子對(duì)照藥材（批號(hào)：121072-201109），甜菜堿對(duì)照品（批號(hào)：110894-200503），以上對(duì)照均購自中國藥品生物制品檢定所；紫元膠囊（規(guī)格：每粒裝0.25 g，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科自制，批號(hào)：130626、130830、131029）；薄層層析硅膠G（青島海洋化工廠）；硅膠G薄層板（自制）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

本品為膠囊劑，取10粒內(nèi)容物，混勻。取少量樣品，用蒸餾水裝片，按粉末特征進(jìn)行鑒別。置顯微鏡40倍目鏡下觀察：淀粉粒單粒三角狀卵形或矩圓形，直徑8～35 μm，臍點(diǎn)點(diǎn)狀、人字狀、十字狀或短縫狀，可見層紋；復(fù)粒稀少，由2～3分粒組成（山藥）[4]。另取少量樣品裝片，滴加水合氯醛試液加熱透化，再加少許稀甘油制片，置顯微鏡下觀察：草酸鈣針晶束存在于黏液細(xì)胞中，長約240 μm，針晶粗2～5 μm（山藥）[4]。種皮石細(xì)胞不規(guī)則多角形，壁厚，波狀彎曲，層紋清晰（枸杞子）。不規(guī)則顆粒狀團(tuán)塊及分支狀團(tuán)塊無色，遇水合氯醛試液逐漸溶化，菌絲無色或淡棕色，細(xì)長，稍彎曲，有分支，直徑3～8 μm，少數(shù)至16 μm（茯苓）[5]。在制劑有效期內(nèi)，該鑒別均符合規(guī)定。取三批不同批號(hào)的樣品依法檢驗(yàn)，結(jié)果均滿意。結(jié)果見圖1。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 紫河車

供試品溶液的制備：取本品5粒，倒出內(nèi)容物，加三氯甲烷10 mL，超聲30 min，濾過，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另取紫河車對(duì)照藥材0.5 g，同供試品溶液制備方法，制成對(duì)照藥材溶液。取不含紫河車的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以20%高氯酸溶液，105℃烘約5 min至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照于相應(yīng)的位置上不產(chǎn)生斑點(diǎn)。證明用處方中其他藥材對(duì)紫河車的鑒別無干擾，結(jié)果見圖2（封四）。在制劑有效期內(nèi)，取三批不同批號(hào)的樣品，依法檢驗(yàn)，結(jié)果均滿意。

2.2.2 枸杞子

取本品10粒，倒出內(nèi)容物，加熱回流80 mL，煮沸15 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次15 mL，合并提取液，蒸干殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對(duì)照藥材0.5 g，同供試品溶液制備方法，制成對(duì)照藥材溶液。按處方比例稱取除枸杞子以外的藥材，研細(xì)，按本品制備工藝及供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一市售硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4∶3∶0.8∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照于相應(yīng)位置上不產(chǎn)生斑點(diǎn)。證明處方中其他藥材對(duì)枸杞子的鑒別無干擾，結(jié)果見圖3（封四）。在制劑有效期內(nèi)，該鑒別均呈正反應(yīng)。取三批不同批號(hào)的樣品，依法檢驗(yàn)，結(jié)果均滿意。

2.3 甜菜堿的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%四氫呋喃（85∶15）；檢測(cè)波長為192 nm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；理論塔板數(shù)按甜菜堿峰計(jì)算不低于2000[6-7]。甜菜堿的保留時(shí)間約為30.0 min。

2.3.2 溶液的配制

2.3.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取甜菜堿對(duì)照品29.22 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品適量，研細(xì)，精密稱取1 g，置于錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱定重量，超聲1.0 h，放冷，甲醇補(bǔ)足減重，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 專屬性試驗(yàn)

按處方比例和供試品制備工藝不加枸杞子制成陰性對(duì)照，按“2.3.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液，供試品溶液與陰性對(duì)照各20 μL，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖4。

2.3.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取甜菜堿儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=5356.6X-22.102，r = 1.0（n = 5）。結(jié)果表明，甜菜堿濃度在0.02922～0.46752 mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

取“2.3.2.2”項(xiàng)下的甜菜堿對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，甜菜堿峰面積的RSD為1.68%。結(jié)果表明該方法的精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)下的樣品，按“2.3.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，在常溫下分別于0、1、2、4、6 h進(jìn)樣，記錄甜菜堿峰面積，RSD為2.05%。表明樣品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)下的樣品5份，按“2.3.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣，平均含量為2.66 mg/g，RSD為1.64%。說明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：131029）0.5 g，共9份，分別置于圓底燒瓶中，按低、中、高三個(gè)濃度分別精密加入甜菜堿儲(chǔ)備液1、2、3，按“2.3.2.3”項(xiàng)下樣品制備方法即得。精密吸取上述供試液各20 μL注入色譜儀，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。平均回收率為101.44%，RSD為1.85%（n = 9）。

2.3.9 樣品含量測(cè)定

取三批（批號(hào)：130626、130830、131029）紫元膠囊，按“2.3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果甜菜堿含量分別為1.07、1.90、0.66 mg/粒。

3 討論

方中山藥的淀粉粒、針晶束，枸杞子的種皮石細(xì)胞，茯苓的團(tuán)塊和菌絲在顯微鏡下明顯易察見，故選入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。其他顯微特征如枸杞子中的外果皮表皮石細(xì)胞和中果皮薄壁細(xì)胞、山藥中的導(dǎo)管，重現(xiàn)性差，不易察見。為保證質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的合理性，未選用這些顯微特征作為鑒別依據(jù)。

紫河車在2010年版《中國藥典》中并無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[8]，但為方中君藥，筆者對(duì)其進(jìn)行了薄層色譜鑒別，在試驗(yàn)過程中，曾選用正己烷-乙酸乙酯（8∶5）、正己烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶1）為展開劑，對(duì)比發(fā)現(xiàn)正己烷-乙酸乙酯（8∶5）拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，且主斑點(diǎn)的Rf值較低，加入一定比例的甲酸能夠很好地去除拖尾現(xiàn)象，增加Rf值，展開效果理想。

加入少量酸、堿于展開劑中可改善斑點(diǎn)的拖尾現(xiàn)象[3]，同時(shí)酸、堿在展開劑中的比例多少亦會(huì)影響Rf值的大小，操作過程中要根據(jù)實(shí)際情況增減。

枸杞子為方中臣藥，果實(shí)含甜菜堿、胡蘿卜素、酸漿紅素等多種維生素，黃酮類及游離氨基酸，牛磺酸等[9]。參照藥典和原標(biāo)準(zhǔn)中枸杞子的鑒別方法，選擇黃酮類成分為其觀察指標(biāo)，用乙酸乙酯-二氯甲烷-甲酸（3∶2∶1）為展開劑展開，結(jié)果Rf值為0.89，Rf值過高，超出有效范圍（0.2～0.8）。改用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4∶3∶0.8∶0.1）為展開劑，在市售硅膠G板上展開，結(jié)果Rf值為0.58，效果理想。

本文在選擇流動(dòng)相時(shí)，參考相關(guān)文獻(xiàn)中甜菜堿的含量測(cè)定方法，對(duì)三種流動(dòng)相進(jìn)行了試用，結(jié)果正相色譜異丙醇不出峰；反相色譜甲醇-水（50∶50）出峰太快，達(dá)不到分離效果；乙腈-0.1%四氫呋喃（85∶15）出峰時(shí)間、分離度等均較好，故選擇其為最佳流動(dòng)相。

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（收稿日期：2015-03-04 本文編輯：李亞聰）