顯色基質法檢測乳酸環丙沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素

曾云勝 張玲莉

[摘要] 目的 比較顯色基質法與凝膠法檢測乳酸環丙沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素的效果。 方法 采用樣品稀釋法研究顯色基質鱟試劑對不同批號乳酸環丙沙星氯化鈉注射液的干擾，并與凝膠法鱟試劑對樣品的干擾試驗比較。 結果 顯色基質法標準曲線的線性相關系數≥ 0.98，乳酸環丙沙星氯化鈉注射液在0.5 mg/mL濃度時無干擾作用，明顯高于凝膠法無干擾濃度（0.125 mg/mL）。 結論 與凝膠法比較，顯色基質法有靈敏、快速、能定量、重復性好的特點，可用于乳酸環丙沙星氯化鈉注射液內毒素含量的測定。

[關鍵詞] 顯色基質鱟試劑法；凝膠法；細菌內毒素；干擾試驗；乳酸環丙沙星氯化鈉注射液

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（c）-0092-04

注射用乳酸環丙沙星具有廣譜抗菌作用，是較早應用于臨床的喹諾酮類藥物，尤其對需氧革蘭陰性桿菌引起的感染有效，由于其價格低廉，療效明確，因此在臨床上被廣泛應用。2010年版《中國藥典》規定乳酸環丙沙星氯化鈉注射液熱原檢測采用家兔法[1]，國家藥典委員會于2012年8月3日已經公布的《關于注射用乳酸環丙沙星的國家標準草案的公示》，其中規定了“細菌內毒素檢查”，用0.06 EU/mL或更高靈敏度的鱟試劑凝膠法檢查（《中國藥典》2010版二部附錄ⅪE[1]），每毫克環丙沙星中含內毒素的量應小于0.50 EU。在凝膠法檢查基礎上，筆者依顯色基質法規定，通過試驗進行乳酸環丙沙星氯化鈉注射液中顯色基質法檢查的方法學研究，以期為環丙沙星檢測內毒素尋求較為合適的方法。

細菌內毒素檢查法是檢測供試品中細菌內毒素的限量的方法，主要方法分為凝膠法和光度測定法，后者包含濁度法和顯色基質法。法定標準規定越來越多的注射制劑采用此法控制藥品中熱原的含量。近年來，藥典委員會要求各地藥檢部門做了很多工作，研究細菌內毒素檢測方法的合理性和可靠性。筆者對乳酸環丙沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素檢測進行方法學研究，建立了顯色基質法檢測該藥中細菌內毒素方法，相比凝膠法，更快速準確。

1 儀器與試劑

1.1 顯色基質鱟試劑盒

顯色基質鱟試劑（批號：120603）1.7 mL，顯色基質（批號：120605）1.7 mL，偶氮化試劑一（批號：120628）10 mL，偶氮化試劑二（批號：120629）10 mL，偶氮化試劑三（批號：120630）10 mL，HCl反應終止劑（批號：120623）50 mL。由廈門市鱟試劑試驗廠有限公司生產。

1.2 凝膠法鱟試劑

鱟試劑（靈敏度0.25 EU/mL，廈門市鱟試劑試驗廠有限公司，批號：130917）；鱟試劑（靈敏度0.03 EU/mL，廈門市鱟試劑試驗廠有限公司，批號：030511）；鱟試劑（靈敏度0.03 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司，批號：1301161）。

1.3 其他試劑

細菌內毒素標準品（CSE）（100 EU/支，中國藥品生物制品檢定所，批號：150608-201298）；細菌內毒素檢測用水（BET水）（廈門市鱟試劑試驗廠有限公司，批號：130428）50 mL。

1.4 樣品

乳酸環丙沙星氯化鈉注射液（商品名：西普樂，拜耳制藥有限公司，100 mL∶0.2 g∶0.9 g）3批（批號：BXGG4D7、BXGG4F1、BXGG4C6）。

1.5 其他材料

紫外可見分光光度計UV-2450（日本島津儀器公司），除熱原吸頭（200、1000 μL），玻璃比色杯（0.5 cm），渦旋混合儀Vortex-Genie 2（美國Scientific Industries），電熱恒溫水浴鍋TZL-5003（蘇州珀西瓦爾試驗設備有限公司），定量可調移液器（上海求精玻璃儀器廠，100～1000 μL，20～200 μL）盛冰水托盤，試管架。

2 方法與結果

2.1 確定供試品內毒素限值

細菌內毒素限值L=K/M，其中K表示人每千克體質量每小時最大可接受的細菌內毒素劑量，藥典規定一般注射劑為5 EU/（kg·h），M表示人每千克體質量每小時的最大供試品劑量[1]。乳酸環丙沙星氯化鈉注射液說明書規定成人1 h靜注最大劑量600 mg，人均體質量按60 kg估算，則M=10 mg/（kg·h）。計算得出本品的細菌內毒素限值L=0.5 EU/mg，環丙沙星氯化鈉注射液的濃度為2 mg/mL，限值即為L=1 EU/mL。

2.2 可靠性試驗

顯色基質法標準曲線的繪制：取細菌內毒素標準品（CSE）1支，加入1 mL BET水復溶，旋渦震蕩混合15 min，即得100 EU/mL細菌內毒素溶液，然后取0.1 mL細菌內毒素溶液，加入BET水0.9 mL，渦旋震蕩30 s，稀釋為10 EU/mL，再繼續用BET水將其稀釋至1 EU/mL細菌內毒素母液，備用。取相應量鱟試劑、顯色基質、偶氮化試劑二、偶氮化試劑三分別用BET水溶解，偶氮化試劑一用HCl反應終止劑溶解，震蕩10 s，備用。取2 mL空安瓿15支，分別加入細菌內毒素檢查用水（1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mL）和1 EU/mL的細菌內毒素母液（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL）制成系列細菌內毒素標準溶液（分別含有細菌內毒素0、0.2、0.4、0.6、0.8 EU/mL）。取標準溶液0.1 mL分別加入反應試管中（冰浴，預先加有0.1 mL鱟試劑的除熱原玻璃試管10 mm×75 mm），震蕩10 s后，置于37℃水浴箱中孵育10 min，取出試管；加入顯色基質0.1 mL（冰浴），再置入37℃水浴箱孵育6 min，取出試管；迅速加入偶氮試劑一（冰浴）、偶氮試劑二、偶氮試劑三各0.5 mL。靜置5 min后，檢測樣品反應液在545 nm處的吸光度，用空白對照管校正。平均吸光度測定值依次為0.03、0.153、0.311、0.456、0.641。平均吸光度對內毒素濃度作線性回歸，得標準曲線Y=0.7256X+0.1878（r=0.9972），r ≥ 0.98，試驗有效。