桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量測定

銀慧慧等

[摘要] 目的 測定桃金娘根中沒食子酸和總多酚的含量。 方法 沒食子酸的含量測定采用超高效液相色譜法。色譜條件：以甲醇-0.5%磷酸（15︰85）為流動相，采用二級管陣列檢測器（PDA）檢測，檢測波長為215 nm，流速為0.2 mL/min。總多酚的含量測定采用分光光度法，以沒食子酸為對照品，福林酚試劑為顯色劑，在748 nm波長下進行測定。 結果 沒食子酸在3.853～115.6 μg/mL（r = 0.9999）濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回收率為98.73%～100.76%。總多酚分析的線性范圍為1.0～7.0 μg/mL（r = 0.9995），回收率為98.04%～101.17%。 結論 該方法簡便、快速、重現性好，可用于桃金娘根的質量控制及定量分析。

[關鍵詞] 桃金娘根；沒食子酸；總多酚；超高效液相色譜法；分光光度法

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（c）-0096-04

Determination of gallic acid and total polyphenol in Radix Rhodomyrti

YIN Huihui LIU Wei JIANG Yuanming MENG Fei QIN Zhenhua GUO Shankang ZHAO Wu SUN Jianhua

Veterinary Institute of the Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccine and New Technology， Guangxi， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To determine the content of gallic acid and total polyphenol in Radix Rhodomyrti. Methods Gallic acid in Radix Rhodomyrti was determined by ultra performance liquid chromatography （UPLC） with photo-diode-array （PDA） at 215 nm， and the mobile phase was methol-0.5% phosphate acid solustion （15∶85） at a flow rate of 0.2 mL/min. The content of total polyphenol was analyzed by spectrophotometry at 748 nm， gallic acid was selected as the reference substance. The colour-developing agent was Folin-Ciocalteu′s phenol reagent. Results The linear range for gallic acid and total polyphenol was 3.853-115.6 μg/mL （r = 0.9999） and 1.0-7.0 μg/mL （r = 0.9995） respectively. The recovery rate of gallic acid was 98.73%-100.76% and recovery rate of total polyphenol was 98.04%-101.17%. Conclusion The method is simple， rapid and good reproducible， can be used for quality control and quantitative analysis of Radix Rhodomyrti.

[Key words] Radix Rhodomyrti； Gallic acid； Total polyphenol； UPLC； Spectrophotometry

桃金娘[Rhodomyrtus tomentosa（Ait.） Hassk]是一種優良的野生植物資源，尤盛產于中國和日本的南部等地區[1-2]；桃金娘根（Radix Rhodomyrti）為桃金娘的干燥根，含有黃酮苷、花色苷等黃酮類成分以及植物多糖成分和沒食子酸等化合物多種活性成分[3-5]，以“通經活血、收斂止血”功效收載于《獸藥國家標準（化學藥品、中藥卷）第一冊》中[6]。沒食子酸是可水解鞣質的組成部分[7-8]，具有抗感染、抗突變、抗氧化等多種生物學活性[9-10]。

桃金娘根藥材及飲片質量標準首次收載于農業部《獸藥規范》1992版二部[11]，并未收入以后各版《中國獸藥典》，該質量標準一直沿用至今[12]。該質量標準相對比較簡單，專屬性不強，也不夠全面，未對其所含特征性生物活性成分進行色譜法鑒別，也未建立科學、準確、靈敏的光譜，色譜及質譜等方法對特征化學成分進行含量測定。因此，測定桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量并對其進行質量評價，為深入研究其藥物作用機制具有重要意義。本文采用超高效液相色譜法[13-15]和分光光度法分別測定桃金娘根中沒食子酸和總多酚的含量，方法簡單快捷，重現性好，可作為桃金娘沒食子酸、桃金娘多酚等特征性化學成分定性鑒別或定量檢測的一種方法，從而完善桃金娘中藥材質量標準，加強桃金娘根藥材或飲片的質量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相色譜帶二級管陣列檢測器（photo-diode-array，PDA），EmpowerTM3色譜工作站，配BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美國Waters公司）；UV2550紫外-可見分光光度計（日本島津）；SK7200HP型超聲波清洗器（上海科導）；Milli-Q超純水儀（Millipore公司）；SQP型（精度0.01 mg）電子天平（德國Sartorious公司）；CAP225D型（精度0.1 mg）電子天平（德國Sartorious公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純，美國Tedia公司），0.2 μm混合濾膜（美國Waters公司）；沒食子酸對照品（≥ 98%，北京恒元啟天化工技術研究院、北京世紀奧科生物技術有限公司聯合研制）；福林酚試劑（0.5 mol/L，上海荔達生物科技有限公司）；磷酸（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；桃金娘根藥材：玉林1、2、3號（產地廣西玉林，經廣西植物研究所溫放副研究員鑒定）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 沒食子酸測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸（15∶85）；流速：0.2 mL/min；檢測波長：215 nm；進樣量：1 μL[16]。

2.1.2 標準溶液的配制 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成濃度為115.6 μg/mL的標準儲備液，放4℃冰箱備用。

2.1.3 標準曲線的繪制 將沒食子酸對照品溶液按不同倍數稀釋，按“2.1.1”項下條件對不同濃度的沒食子酸標準溶液進行色譜分析測定，以沒食子酸峰面積（Y）對質量濃度（X）進行回歸分析，得到回歸方程和相關系數為：Y=21040X+4663.4，r = 0.9999（n = 6）。結果表明，沒食子酸在3.853～115.6 μg/mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。對57.80 μg/mL沒食子酸標準溶液進行平行測定（n = 6），峰面積和峰高遷移時間的RSD分別為0.9%和1.1%。圖1A是沒食子酸標準樣品的超高效液相色譜圖。

2.1.4 供試品溶液制備及沒食子酸含量的測定 供試品溶液制備：桃金娘根藥材，打粉，過五號篩，取0.3 g細粉，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲（350 W，53 kHz，30℃）提取40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，放4℃冰箱備用。含量測定時過0.2 μm濾膜后供測試用。沒食子酸含量測定：在“2.1.1”色譜條件下對供試品溶液進行檢測，根據標準曲線計算沒食子酸含量。樣品分析色譜圖見圖1B，桃金娘根中沒食子酸含量見表1。

2.1.5 精密度試驗 取桃金娘根藥材（玉林1號）粉末0.3 g，精密稱定，按“2.1.4”制備供試品溶液，進樣量為1 μL，重復進樣6次，測定沒食子酸峰面積，并計算沒食子酸含量，測得沒食子酸含量的RSD為1.1%。

2.1.6 穩定性試驗 取桃金娘根藥材（玉林1號）粉末0.3 g，精密稱定，按“2.1.4”制備供試品溶液，在室溫下保存，分別于0、1、2、4、6、8、24、36、48 h測定沒食子酸的峰面積，測得沒食子酸含量的RSD為0.8%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.1.7 回收率試驗 精密稱取已知沒食子酸含量的桃金娘根樣品（玉林1號）9份，分別向每份添加一定濃度的沒食子酸標準溶液，每個濃度制備三份平行樣品，測定其回收率，結果見表2。

2.2 總多酚含量分析

2.2.1 實驗方法 采用紫外-分光光度法對桃金娘根中總多酚進行檢測[17]。精密吸取待測樣品溶液100 μL于10 mL容量瓶中，加入3 mL超純水，搖勻，再加入0.5 mL福林酚試劑，充分搖勻。1 min后再加入2.5 mL 20%Na2CO3溶液，用超純水定容至刻度，混勻。25℃下避光反應90 min后，以顯色劑為空白，在748 nm波長處測定吸光度A（沒食子酸對照品和桃金娘根供試品吸收光譜圖見圖2）。根據標準曲線，計算出桃金娘根總多酚的含量。

2.2.2 對照品溶液的配制和標準曲線的繪制 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，用超純水溶解，配制成濃度為98.8 μg/mL標準儲備液。分別精密吸取對照品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7 mL置于10 mL棕色容量瓶中，按“2.2.1”項進行顯色和測定，以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標，進行回歸分析得到線性回歸方程：A=0.0953C+0.0738，r = 0.9995（n = 6）。結果表明，沒食子酸含量在1.0～7.0 μg/mL范圍內呈現良好線性關系。

2.2.3 供試品的配制和含量分析 供試品溶液制備：桃金娘根藥材，打粉，過五號篩，取0.3 g細粉，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲（350 W，53 kHz，30℃）提取40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，放4℃冰箱備用。含量分析：同“2.2.1”試驗方法項下進行顯色和測定。根據標準曲線計算總多酚含量，桃金娘根中總多酚含量見表1。

2.2.4 精密度試驗 取桃金娘根樣品（玉林1號）按上述樣品溶液配制方法及測定方法，測定吸光度值，重復測定6次，RSD為0.87%。表明該比色法具有較高的精密度，重復性好，可以滿足桃金娘根中總多酚分析的要求。

2.2.5 穩定性試驗 評價該比色法在一段時間內的穩定性，取桃金娘根樣品（玉林1號）按上述樣品溶液處理方法及測定方法，待比色體系完全反應后，在25℃下繼續放置30、60、90、120、150 min，然后測定吸光度值，隨著時間的延長，其值有下降趨勢，但幅度不大，RSD為1.0%。

2.2.6 回收率試驗 精密稱取已知總多酚含量的桃金娘根樣品（玉林1號）9份，分別向每份添加一定濃度的沒食子酸標準溶液，每個濃度制備三份平行樣品，按“2.2.1”方法顯色和含量測定，計算回收率，結果見表3。

3 討論

桃金娘是中國南方地區民間傳統習用中草藥，味甘、澀、平，具有清熱解毒、收斂止瀉、理氣止痛、祛風活絡、祛瘀止血、安胎功效，常用于急、慢性腸胃炎，消化不良，痢疾，腹瀉，嘔吐泄瀉，脘腹疼痛等臨床病癥。隨著桃金娘化學成分研究不斷深入和綜合開發力度不斷加大，桃金娘化學成分及生物活性研究取得廣泛的研究成果；鞣酸及多酚類是桃金娘中藥材主要有效化學成分之一，具有收斂、止瀉，抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等生物活性[12]。

采用超高效液相色譜法檢測桃金娘根中沒食子酸含量。對供試品溶液色譜圖中沒食子酸色譜峰進行純度檢查，并與光譜庫進行匹配，結果顯示，色譜峰純度角小于純度閾值，表明供試品溶液中1.927 min處的峰為單一峰；匹配角度小于匹配閾值，表明供試品溶液中相應色譜峰的光譜與沒食子酸光譜庫的光譜非常相似，可認為是同一物質。測得玉林桃金娘根藥材中沒食子酸含量分別為1.73、1.48、1.65 mg/g。采用福林酚試劑法和紫外-分光光度法測定桃金娘根中總多酚，含量分別為79.21、67.19、74.33 mg/g。資料表明，本試驗是對桃金娘沒食子酸、總多酚進行的首次定量分析研究。

中藥材及飲片的質量標準是保證中藥材及飲片質量，體現中藥行業管理技術水平先進程度的重要標志；制訂與國際醫藥行業接軌的中藥材質量標準是促進中藥材走向國際市場、實現中藥材現代化的有效途徑。本試驗建立的檢測桃金娘沒食子酸超高效液相色譜檢測技術和總多酚含量紫外-分光光度檢測技術，方法科學、靈敏度高、快速、重復性好，可作為桃金娘沒食子酸、桃金娘多酚等特征性化學成分定性鑒別或定量檢測的一種方法，從而完善桃金娘中藥材質量標準，加強桃金娘根藥材或飲片的質量控制。同時，隨著桃金娘化學成分和生物活性研究的不斷深入，匯集化學成分-藥效-藥理研究成果，研究更能全面反映桃金娘藥材內核本質的色譜或光譜指紋圖譜，對桃金娘中藥材種植、采制、流通規范化和質量管理的科學化及深入開發桃金娘新制劑均有深遠意義。

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（收稿日期：2015-03-20 本文編輯：李亞聰）