疏肝理氣、化濕活血法對胰島素抵抗3T3-L1 細胞FGF-21 水平及其受體表達的影響

龍 艷，孫 璐，范冠杰

（1.廣州市中西醫結合醫院，廣東廣州510080；2.廣東省中醫院，廣東廣州510120）

胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是糖尿病的主要發病機制之一，它表現為胰島素的靶器官或靶組織（肝臟、肌肉、脂肪組織、胰島β 細胞本身）對胰島素的敏感性及反應性降低，多認為其機制與胰島素受體或受體后缺陷導致胰島素的細胞信號轉導異常有關[1]。改善IR、提高機體的胰島素敏感性是治療糖尿病尤其是早期糖尿病的關鍵。越來越多的研究表明，人體多種細胞因子參與了胰島素抵抗的發生發展過程[2]，其中成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor，FGF-21）具有不依賴于胰島素分泌的獨立的糖-脂代謝調控作用，它通過與FGF 受體（FGFRs）結合啟動細胞內信號轉導，發揮增強胰島素敏感性的作用[3-6]。有研究證實，疏肝理氣、化濕活血法具有改善胰島素抵抗作用[7-8]。因此，本研究選取小鼠脂肪細胞3T3-L1 為研究對象，探討疏肝理氣、化濕活血法中藥對脂肪細胞胰島素抵抗的改善作用及其與FGF 信號通路之間的關系，現將研究報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞株與實驗動物

小鼠3T3-L1 前脂肪細胞株購自中國科學院上海細胞庫。成年雄性SD 大鼠12 只，體質量180～220g，SPF 級，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）20050020。

1.2 主要儀器與試劑

胎牛血清、DMEM-高糖培養基、青鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國Hyclone 公司；油紅O、地塞米松、重組人胰島素購自美國sigma 公司；葡萄糖檢測分析試劑盒II（美國Biovision 公司），鼠FGF-21 ELISA 檢測試劑盒（美國millipore公司），熒光定量PCR 混合液（日本TOYOBO 公司）、寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸Oligo（dT）15（primer 公司）；脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP mix）、隨機引物、RNasin 核酸酶抑制劑、M-MLV 反轉錄酶均購自美國Promega 公司。CKX41 倒置光學顯微鏡（日本OLYMPUS 公司），HERACELL150i 細胞恒溫培養箱（美國Thermo 公司），DMI6000B 倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司），D3 核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf），ABI 7700 核酸序列檢測儀（美國ABI 公司）。

1.3 實驗藥品及含藥血清的制備

中藥方劑組成：柴胡10g，白芍15g，薄荷5g（后下），牡丹皮15g，蒼術10g，黃柏10g，薏苡仁30g，綿茵陳30g，車前草30g，丹參15g，莪術10g，澤蘭15g，甘草5g。蒸餾水翻煎3 遍，過濾、濃縮，4℃冰箱保存備用。制備含藥血清：將成年雄性SD 大鼠隨機分為對照組、中藥組及西藥吡格列酮組，每組4 只。按體表面積折算法將藥品折算成大鼠等效劑量的10 倍灌胃給藥（中藥216g/kg.d-1，西藥4.05mg/kg），對照組予灌胃相同體積蒸餾水，2 次/d，連續5d，末次灌胃后3h，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，無菌條件下腹主動脈取血，低溫離心3000r/min×20min，取上層血清以0.22μm 濾膜過濾除菌，凍存管分裝，－20℃保存備用。

1.4 3T3-L1 前脂肪細胞的誘導分化

參照Anil Kumar[9]報道的方法對前脂肪細胞進行分化。將3T3-L1 前脂肪細胞按5×104/mL 密度接種于6 孔培養板，待細胞匯合約達80%，將培養基換成誘導培養基1（10%胎牛DMEM 高糖培養基，含0.5mmol/L IBMX、0.25μmol/L 地塞米松、0.26IU/mL 胰島素）處理48h，然后換以誘導培養基2（10%胎牛血清的DMEM 培養基，含0.26IU/mL人胰島素） 處理48h，再換用10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基維持培養，每2d 換液1 次。在倒置顯微鏡下動態觀察細胞形狀，培養8d 后，約90%以上細胞呈現成熟脂肪細胞形態，即可開始下一步實驗。

1.5 胰島素抵抗細胞模型的復制及分組給藥

參照文獻[10]方法建立胰島素抵抗模型。將分化成熟的脂肪細胞以無血清的低糖（5.5mmol/L）DMEM 培養基同步化24h，再換以含1μmol/L 地塞米松的完全培養基孵育48h，用葡萄糖檢測試劑盒測定細胞上清液中葡萄糖含量，以未接種細胞的空白培養基為對照，計算葡萄糖消耗量，用來評估細胞模型。造模成功后予換液，同時將細胞隨機分為以下5 組：A、正常組：正常脂肪細胞，以含10%胎牛血清＋10%正常大鼠血清的高糖DMEM 培養基培養；B、模型組：胰島素抵抗脂肪細胞，以含10%胎牛血清＋10%正常大鼠血清的高糖DMEM 培養基培養；C、吡格列酮組：胰島素抵抗脂肪細胞，以含10%胎牛血清＋10%吡格列酮大鼠血清的高糖DMEM 培養基培養；D、中藥高劑量組：胰島素抵抗脂肪細胞，添加含10%胎牛血清＋10%中藥大鼠血清的高糖DMEM 培養基培養；E、中藥低劑量組：胰島素抵抗脂肪細胞，添加含10%胎牛血清＋5%中藥大鼠血清的高糖DMEM 培養基培養。每組設立3 個復孔，重復試驗3 次。分組的同時設立未接種細胞的空白培養基孔作為對照。以上藥物處理的濃度及時間均根據預實驗結果而確定。

1.6 葡萄糖消耗量及FGF-21 水平測定

分別在中藥含藥血清處理后第24h、48h，吸取細胞上清液，采用葡萄糖氧化酶法檢測各孔培養液中葡萄糖濃度，具體操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。將所得各孔葡萄糖濃度與未接種細胞的空白DMEM 高糖培養基孔的葡萄糖濃度相減，算出葡萄糖消耗量。同時，采用ELISA 法檢測細胞上清液中FGF-21 濃度。

1.7 引物設計及FGFR1、FGFR2 基因相對表達量檢測

參照Genebank 中提供的小鼠FGFR1、FGFR2和GAPDH 的mRNA 序列，應用primer5.0 引物設計軟件設計引物，上海英俊生物技術有限公司合成。內參GAPDH 引物序列：正義鏈5’-GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA-3’，反義鏈5’-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3’，PCR 產物141bp。目的基因FGFR1引物序列：正義鏈5’-TTATCCTGGGCGTGTGAAAA -3’， 反 義 鏈5’-CCAATGCATCGGGAGATAGA-3’，PCR 產物160bp。目的基因FGFR2 引物序列：正義鏈5’-CTTCTGCCCGGGTTACACAT-3’，反義鏈5’-CCGAATGATGCTGGGCTTT-3’，PCR產物140bp。細胞經分組藥物處理48h 后，采用Trizol 試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR 法檢測FGFR1 和FGFR2基因相對表達量水平。PCR 循環參數：95℃10min→95℃15s→60℃30s→72℃32s，讀板，共40 個循環。

1.8 表達差異的計算方法

用2-ΔΔct值表示基因相對表達量。通過軟件計算出所有樣本內參照和目的基因的循環閾值Ct值，再計算ΔCt＝（目的基因Ct－內參Ct）的平均值±標準偏差，然后再計算ΔΔCt＝（待測樣品中目的基因ΔCt－參照樣品中目的基因ΔCt）的平均值±標準偏差（若無參照樣品則選擇Ct 最大的樣品為參照進行計算），最后基因相對表達量＝（2-ΔΔct）的平均值±標準偏差。

1.9 統計學處理

采用stata11.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以（x±s）表示，方差齊者，采用t 檢驗，方差不齊或非正態性分布資料采用秩和檢驗；多組計量資料比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Bonfferoni 法，方差不齊者或小樣本資料則采用H 檢驗。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3T3-L1 前脂肪細胞的分化及鑒定

于倒置顯微鏡下動態觀察細胞形態，分化前的3T3-L1 前脂肪細胞呈梭型、不規則形狀，胞質內少量脂滴；隨著誘導分化時間的延長，細胞形狀逐漸變圓，胞質內脂滴逐漸增多，可見部分大脂滴；誘導分化第8 天，大部分細胞呈橢圓形或圓形，脂滴逐漸匯合，并聚集于核周，形成典型的“戒環樣”結構；經油紅“O”染色后，可見90%以上細胞胞質可特異性著橘紅色，提示細胞已分化為成熟脂肪細胞（見圖1）。

圖1 3T3-L1 細胞分化前（A）和分化成熟后（B）形態（×200）

2.2 脂肪細胞胰島素抵抗模型的建立

成熟脂肪細胞培養48h 后，所有細胞上清液的葡萄糖濃度均較未接種細胞的空白培養基孔下降，提示葡萄糖在細胞培養過程中逐漸消耗。以添加1μmol/L 地塞米松共培養的細胞為模型組細胞，同時以未添加地塞米松的細胞作為對照組，孵育48h后，模型組細胞上清中葡萄糖消耗量較對照組低，且差異具有統計學意義（P＜0.01），提示1μmol/L 地塞米松培養48h 可抑制脂肪細胞的葡萄糖消耗，可作為胰島素抵抗細胞模型（表1）。

表1 1μmol/L 地塞米松培養48h 細胞葡萄糖消耗量（x±s）

2.3 疏肝理氣、化濕活血法對脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響

由表2 可見，隨著培養時間的延長，各組細胞上清液中葡萄糖濃度逐漸下降，提示葡萄糖消耗量逐漸增加。模型對照組細胞培養24h、48h 后葡萄糖消耗量均低于同時間點正常對照組（P＜0.01）。添加吡格列酮及中藥含藥血清處理24h 及48h 后，各組細胞上清液中葡萄糖消耗量有不同程度的升高，與同時間點模型對照組比較均具有統計學意義（P＜0.01）。但培養48h 后兩個中藥劑量組均較吡格列酮組葡萄糖消耗量低（P＜0.01）。中藥不同劑量組在2個時段的葡萄糖消耗量無明顯差別（P>0.05）。

表2 各組葡萄糖消耗量（x±s，mmol/L）

2.4 疏肝理氣、化濕活血法對脂肪細胞上清液FGF-21 水平的影響

由表3 可見，隨著培養時間的延長，模型對照組細胞上清液中FGF-21 濃度逐漸升高，培養24h、48h 后均高于正常對照組（P＜0.01），給予中藥或吡格列酮含藥血清處理24h、48h 后FGF-21 濃度均有所下降，與同時段模型對照組比較均具有統計學意義（P＜0.01），其中吡格列酮組FGF-21 濃度較2 個中藥劑量組下降更為明顯（P＜0.01），而中藥高劑量組則較低劑量組下降明顯（P＜0.01）。

表3 各組脂肪細胞上清液FGF-21 水平（x±s，pg/mL）

2.5 疏肝理氣、化濕活血法對脂肪細胞FGFR1 及FGFR2 基因表達的影響

FGFR1、FGFR2 及GAPDH 的擴增曲線平滑，熔解曲線呈特異性單峰，提示PCR 檢測敏感性和特異性較好（圖2）。由表4 可見，細胞培養48h 后，模型對照組較正常對照組FGFR1 相對表達量有所下降，予以中藥或吡格列酮含藥血清處理后均有所回升，經統計學分析，吡格列酮組FGFR1 表達量與模型對照組比較有統計學差異（P＜0.05），但2 個中藥劑量組FGFR1 表達量與模型對照組比較均無統計學差異（P>0.05）。模型對照組FGFR2 基因相對表達量較正常對照組明顯降低（P＜0.01），經中藥高劑量或吡格列酮含藥血清處理48h 后其表達量有所回升，與模型對照組比較均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），吡格列酮組較中藥組FGFR2 表達量回升更為顯著，二者比較有統計學差異（P＜0.01）。

圖2 各基因的擴增曲線和熔解曲線圖

表4 各組FGFR1 及FGFR2 基因相對表達量（x±s）

3 討論

IR 是2 型糖尿病和代謝綜合征的典型特征，也是諸多心血管疾病的危險因素[11]。脂肪組織在IR 的發生發展中發揮著關鍵作用[12]，它主要通過分泌多種脂肪細胞因子，干擾正常的胰島素信號轉導，導致IR 的發生[13]。FGF-21 是新近發現的一種脂肪細胞因子，是FGFs 超家族成員之一，主要在肝臟、脂肪組織、胰腺中表達[14-15]。FGF-21 是一個重要的代謝調節因子，研究發現FGF-21 可增強小鼠3T3-L1脂肪細胞和人類前脂肪細胞的葡萄糖攝取能力，肝臟過表達FGF-21 的轉基因小鼠其胰島素敏感性和葡萄糖清除率增強，血清甘油三酯濃度降低，給該小鼠喂食高脂肪飲食后可明顯抑制體重增加；同時該研究小組發現，給肥胖、胰島素抵抗小鼠（ob/ob或db/db）或肥胖Zucker 糖尿病大鼠注射重組FGF-21 后可降低其血糖及血胰島素水平[3]。人體研究觀察到T2DM 患者FGF-21 水平明顯高于正常對照組，而且FGF-21 水平與胰島素敏感性負相關，而與胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、血糖及糖化血紅蛋白水平（HBA1c）正相關[16]。FGF-2I 主要通過經典的FGF 受體（FGFRs）起作用，它可誘導FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3 酪氨酸磷酸化[17-18]，并進一步激活細胞內ERKI/2 及Akt 等信號途徑，發揮其糖脂代謝調節作用[19]。另外也有研究發現，T2DM 患者經PPAR-γ 激動劑降糖治療后，血漿FGF-21 水平較治療前明顯降低了，提示FGF-21 可能通過PPARγ 途徑發揮其生理作用[20]。

肝氣郁滯兼有濕濁、血瘀是糖尿病較為常見的復雜病機之一。尤怡《金匱要略心典·消渴小便利淋病脈證并治第十三》云：“夫厥陰風木之氣，能生陽火而爍陰津，津虛火實，臟燥無液，求救于水，則為消渴。”肝失疏泄，肝木乘脾，致脾虛運化失職，痰濕內生；而肝氣不暢，痰濕內阻，日久可致血行遲澀，血脈瘀阻。現代研究也表明，疏肝解郁、健脾化濕活血等治法能改善胰島素抵抗[7-8]。

因此，針對肝氣郁滯兼夾濕濁、血瘀的復雜病機，運用疏肝理氣、化濕活血法，觀察相應的方劑對3T3-L1 細胞IR 的改善作用并探討其作用機制，具有一定的理論依據。本研究結果表明，疏肝理氣、化濕活血法可明顯增加3T3-L1 細胞葡萄糖消耗量，減輕IR，并使得IR 狀態下升高的FGF-21 水平降低，使FGFR2 mRNA 表達水平上調。在IR 狀態下，脂肪細胞FGFR2 表達水平明顯下降，而FGF-21 水平反而升高，考慮與細胞代償機制有關[21]。經中藥處理后，細胞FGF-21 水平降低，其原因可能與胰島素抵抗改善后細胞所需FGF-21 減少，FGF-21 水平反饋性降低有關，這與國外研究報道一致[16，22]。而疏肝理氣、化濕活血法在改善3T3-L1 細胞IR 的同時能顯著升高細胞FGFR2 表達量，推測這將有可能使得FGF-21 能與更多的FGFR2 相結合，從而激活FGF 信號途徑，增強FGF-21 調節糖代謝的活性，但其具體的作用途徑尚待進一步的分子研究證實。

綜上所述，疏肝理氣、化濕活血法能顯著改善3T3-L1 脂肪細胞IR 水平，其機制可能與FGF 信號通路的激活有關。本研究為中醫藥防治糖尿病提供了一定的研究思路。但該作用機制與體內胰島素分泌的相互作用關系如何，對FGF 受體后信號轉導途徑的影響如何，以及中藥藥串的具體有效成分是什么，這些問題尚待在今后的研究工作中進一步探討。

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