miR-218和miR-152在漿液性卵巢癌的表達及臨床意義

趙立紅，石淑莉，齊秀玲

（河北廊坊市廣陽區人民醫院婦產科，廊坊 065200）

卵巢惡性腫瘤是一種常見的女性生殖器腫瘤，發病率占婦科腫瘤的25%，其死亡率占據婦科腫瘤的第一位。上皮性卵巢腫瘤是最常見的卵巢腫瘤，占卵巢惡性腫瘤85%～90%，而其中漿液性卵巢癌占上皮性卵巢癌的75%［1-2］，且75%的患者確診時已是晚期，多伴有腹腔等遠處轉移。因此，尋找早期卵巢癌的腫瘤標志物顯得尤為重要。

miRNAs是一種高度保守性的非編碼RNA，在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要的作用，與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲相關［3-4］。miR-218和miR-152表達的改變與腫瘤的惡性程度密切相關。有報道顯示miR-218在腎細胞癌［5］、膀胱癌［6］中表達下調，可抑制卵巢癌細胞［7］、胃腸癌細胞［8］的侵襲轉移；miR-152在卵巢癌［9］、子宮內膜癌［10］、胃癌［11］中呈低表達，與上述腫瘤的發生發展密切相關。但是，miR-218和miR-152在卵巢癌特別是漿液性卵巢癌的研究報道較少。本研究運用Real-time PCR方法，以正常輸卵管傘端組織和良性病變組織為對照，檢測了miR-218和miR-152 在正常卵巢組織、良性病變卵巢組織以及漿液性卵巢癌組織的表達情況，分析探討了其與漿液性卵巢癌病理特征之間的關系以及在漿液性卵巢癌發生發展中的作用。

材料和方法

一、研究對象

正常卵巢組織（正常輸卵管傘端上皮組織）、良性病變卵巢組織以及漿液性卵巢癌組織標本取自于本院2008年7 月至2012 年2 月行手術治療的患者，包括漿液性卵巢癌患者50例、良性上皮性卵巢腫瘤患者20 例以及正常卵巢腹腔鏡活檢病例10例。所有患者均簽署知情同意書。

患者術前均未接受過化療、放療或激素治療，術后均得到病理確診。組織標本離體后10 min內置于液氮罐內迅速冷凍后置-80 ℃保存。

二、試劑和儀器

Trizol、Taqman miRNA 反 轉 錄 試 劑 盒 以 及TaqMan?MicroRNA Assays（miR-218，Cat ＃4427975；miR-152，Cat ＃ 4366596；U6，Cat ＃4440047）（Life Technologies，美 國）；RNase-free H2O（上海生工）；熒光定量PCR 儀ABI 7500（ABI，美 國）；NanoDrop ＠ND-1000 紫 外 分 光 光 度 儀（NanoDrop，美國）。

三、Real-time PCR

1.逆轉錄反應：Trizol法抽提卵巢組織中的總RNA，用TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒中反轉錄酶和miRNA 特異性莖環結構（stem-loop）反轉錄引物進行miRNA 反轉錄反應，操作參照說明書進行。反應體 系 為15μl，包 括3μl 5×反 轉 錄 引 物、0.15μl 100mmol／L dNTP和dTTP混合物、1μl反轉錄酶、1.5μl 10×反轉錄緩沖液、0.19μl RNA 抑制劑以及500ng RNA。反應條件：16 ℃2min，42 ℃1min，50℃1s，上述3步經40個循環反應，再85℃孵育5min。

2.Real-time PCR檢測：應用TaqMan MicroRNA試劑盒對合成的cDNA 進行實時定量PCR 反應。反應條件：95 ℃1min變性，95℃15s、60℃20s、70 ℃15s，40個循環，以U6為內參照；分別以2-△Ct法進行數據分析，實驗重復3 次，其中，△Ct＝Ct（miRNA）-Ct（U6）。TaqMan?MicroRNA Assays所有miRNA 及內參都采用同一個標準反應程序。

四、統計學方法

采用SPSS 11.0軟件進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差表示，采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般資料

組織標本來自本院2008年7月至2012年2月行手術治療的80例患者。患者病歷資料完整，術前均未接受放射治療和化療，術后均經病理明確診斷。

50例卵巢癌患者中，年齡29～73 歲，平均53歲，FIGO I期9例、Ⅱ期12例、Ⅲ期27例、Ⅳ期2例；10例正常卵巢組織患者年齡34～69歲，平均55歲；20例良性上皮性卵巢腫瘤組織患者年齡31～71歲，平均57歲。

二、卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中miR-218和miR-152表達

漿液性卵巢癌組織中miR-218 的相對表達量為404.5，顯著低于正常卵巢組織（相對表達量為598.7）和良性卵巢腫瘤組織（相對表達量為523.3），差異有統計學意義（分別為P＝0.004 和P＝0.000）（圖1A）；漿液性卵巢癌組織中miR-152的相對表達量為382.9，顯著低于正常卵巢組織（相對表達量為678.4）和良性卵巢腫瘤組織（相對表達量為587.3），差異有統計學意義（分別為P＝0.003和P＝0.001）（圖1B）。

圖1 miR-218和miR-152在不同卵巢組織中的表達

三、卵巢癌組織中miR-218和miR-152與臨床病理特征的關系

miR-218下調表達程度與卵巢癌惡性程度、腫瘤分化程度以及腫瘤轉移情況有關。隨著卵巢癌惡性程度的增高，miR-218 表達有下降的趨勢，其中III期、IV 期中miR-218表達顯著低于I期、II期（P＝0.011）；在中低分化癌組織中的miR-218表達顯著低于高分化癌組織（P ＝0.023）；淋巴轉移組miR-218表達顯著低于無淋巴轉移組（P＝0.014）（表1）。

miR-152表達與卵巢癌組織學類型、腫瘤分化程度以及腫瘤轉移情況均無顯著相關性（P＞0.05）（表1）。

表1 漿液性卵巢癌患者臨床病理特征與miR-218和miR-152表達的關系（±s）

表1 漿液性卵巢癌患者臨床病理特征與miR-218和miR-152表達的關系（±s）

注：與臨床病例特征各相應組比較，＊P＜0.05

臨床特征 例數 miR-218表達水平miR-152表達水平年齡（歲） ≥55 39 405.1±0.614 376.1±0.824 ＜55 11 402.4±1.017 384.6±0.472 TNM 分期 I-II期 40 425.4±1.042＊ 394.9±0.198 III-IV 期 10 320.9±1.021 379.9±0.861有無淋巴結轉移 是 29 299.5±0.271＊ 397.8±0.104 否 21 549.5±0.613 372.1±1.012細胞分化程度 高 7 618.5±0.714＊ 406.5±0.121 中-低43 369.6±0.511 379.1±0.638

討 論

卵巢癌是影響女性生命健康的三大惡性腫瘤之一，具有高度侵襲性和致死率的特點［12-13］，尋找有效的診斷及預后評價指標和分子治療靶標已成為目前卵巢癌分子腫瘤學研究熱點。近來miRNAs 成為分子生物學研究的焦點，目前研究表明，miRNA能夠在多種腫瘤中調控腫瘤相關基因的表達而影響細胞增殖、凋亡和遷移等生物學行為［13-15］。miRNA表達失調可能是腫瘤發生發展的潛在因素，比如miR-31、miR-100和miR-200的缺失可促進腫瘤的發展，而miR-21、miR-93和miR-199a等miRNA 的過表達，也可以促進腫瘤細胞的增殖［14-15］。因此，miRNAs在卵巢癌中異常表達，在卵巢癌發病機制中發揮舉足輕重的作用，也是腫瘤早期篩查的潛在生物標志物。

研究表 明，miR-218在 腎 細 胞 癌［5］、膀 胱 癌［6］、頭 頸 鱗 狀 細 胞 癌［16］、胃 癌［17］、肺 癌［18］和 卵 巢癌［19-21］等多種惡性腫瘤中表達下調。本研究采用Real time PCR 技 術 檢 測 了 正 常 卵 巢 組 織、良 性 病變卵巢組織以及漿液性卵巢癌組織中miR-218的表達，發現miR-218 在卵巢癌組織中的表達量明顯低于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織，miR-218 可能作為抑癌基因調節卵巢癌的發生發展過程。

miR-152前體位于人類17 號染色體上，是miR-148／152家族成員之一［20］。miR-152在多種腫瘤中被證實為腫瘤相關miRNA，可以影響腫瘤細胞的生長和轉移。miR-152 在多種腫瘤如卵巢癌［21-23］、子 宮 內 膜 癌［10］、胃 癌［11］呈 低 表 達，可 通 過作用其靶點DNA 甲基化轉移酶1在胃癌中發揮重要的作用［11］。本研究結果發現，miR-152在卵巢癌組織中的表達顯著低于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織（P＜0.01），提示miR-152也可能作為抑癌基因調節卵巢癌的發生發展過程。

本研究中也進行了miR-218 和miR-152 與臨床病理特征的關系研究。在與臨床病理特征的相關性分析中我們發現，miR-218隨著漿液性卵巢癌的臨床分期進展和惡性程度增高如淋巴結轉移而表達降低，表明miR-218表達與卵巢癌臨床進展及轉移呈負相關，與病理分化程度呈正相關。而miR-152在漿液性卵巢癌中的表達與其各臨床病理特征之間無統計學相關，提示miR-152可能主要在漿液性卵巢癌的發生過程中起作用，而與其發展、轉移、侵襲及預后等臨床進展無關。

綜上所述，miR-218和miR-152在漿液性卵巢癌組織中的表達與在正常卵巢組織和良性病變組織中的表達存在差異，且miR-218表達水平與患者臨床進展呈負相關，提示miR-218和miR-152可能成為潛在的卵巢癌診斷和預后判斷標志物和治療靶點。

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