Y 染色體AZFc區完全缺失患者ICSI治療妊娠結局分析

李明昭，趙小利，任文娟，師娟子

（西北婦女兒童醫院生殖中心，西安 710003）

不育影響著大約10%～15%的育齡夫婦，其中由男性因素導致者約占50%，而男性因素中Y 染色體微缺失是一個重要的致病因素［1］。Y 染色體微缺失被認為是男性特發性不育最重要的遺傳學病因，這種微小缺失可以造成不同程度的生精障礙，如無精子癥和嚴重少精子癥等［2］。國內外報道的Y 染色體微缺失主要發生于AZFc區，約占各類缺失的60%［3］。AZFc區缺失者表型多樣，從輕度少精子癥到無精子癥等，約2／3的患者表現為無精子癥，其中約50%的患者經睪丸穿刺可獲得精子，余下1／3的患者多表現為少精子癥。因此，理論上AZFc區缺失可以通過卵胞漿內單精子注射（ICSI）技術獲得自己的后代。但是關于Y 染色體AZFc區缺失是否影響患者ICSI助孕治療的妊娠結局，目前報道較少，且研究結果存在爭議［4］。本研究對我中心確診的AZFc區完全缺失患者的精子獲得率進行統計，分析其中行ICSI鮮胚移植的患者（研究組）和同期行ICSI治療、無AZFc區缺失的無精子癥和嚴重少精子癥患者（對照組）的臨床資料，比較兩組患者的妊娠結局。

一、資料與方法

1.研究對象：收集2013年6月至2014年8月在我中心確診的79例Y 染色體AZFc區完全缺失的患者資料。其中行ICSI治療鮮胚移植的27例患者為研究組，均為嚴重少精子或無精子癥患者；另外，選擇同期在我中心行ICSI治療、無Y 染色體微缺失的嚴重少精子癥和無精子癥患者58例為對照組。我中心診斷為嚴重少精子癥或無精子癥的患者均行Y 染色體微缺失檢測。

研究組患者年齡25～42 歲，對照組患者年齡27～46 歲，均為婚后夫妻生活正常、未采取避孕措施1年以上未育者。排除梗阻性無精子癥及合并其他全身性疾病或嚴重感染的患者。女方不育因素主要包括：輸卵管因素、子宮內膜異位癥、盆腔粘連等。

2.診療回顧：（1）取精：AZFc區完全缺失患者獲取精液的方式包括手淫射精、睪丸穿刺和顯微手術取精。一般AZFc區完全缺失患者進行不育治療前先通過手淫方式留取新鮮精液，行精液常規檢測，確認精液質量是否符合ICSI標準［精液常規處理后前向運動精子總數低于（0.3～2）×106／ml］。如取卵當日男方精液處理后符合ICSI標準，則行ICSI治療；如精液標本不符合ICSI標準，則行睪丸穿刺取精進一步確定是否符合ICSI標準；部分睪丸穿刺后仍不符合ICSI標準的患者，遵循患者意愿嘗試顯微手術取精。本研究中研究組27例患者和對照組58例患者的精液均來自手淫射精。（2）精液分析：按照世界衛生組織（WHO）精液評估標準，連續3次精液分析并經離心沉淀均無精子者視為無精子癥，精子濃度＜5×106／ml者視為嚴重少精子癥［5］。（3）AZF檢測：使用深圳亞能生物技術有限公司提供的Y 染色體微缺失檢測試劑盒，通過多重聚合酶鏈反應（PCR）擴增，檢測Y 染色體AZFc區SY254、SY255、SY242、SY239 的表達情況，內控對照為雄性性別決定基因（SRY），每次檢測均以已育健康男性基因組DNA 作為陽性對照。PCR 反應體系及操作步驟參照試劑盒說明書進行，反應條件：95℃預變性6min，95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環；最后72℃延伸7min。PCR 擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 電壓下電泳90min，使用凝膠成像系統（上海天能）觀察并照相，分析條帶結果。SY254、SY255、SY242、SY239表達均為陽性，則判定為AZFc區完全缺失。（3）控制性促排卵（COH）：所有患者的女性配偶從黃體中期開始給予短效曲普瑞林（博福-益普生，法國）降調節，0.1mg／d，14d后，測定血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）水平，當達到降調標準（FSH＜5 U／L，LH＜5 U／L，E2＜110pmol／L）后，使用促性腺激素（Gn）促排卵，當3個以上卵泡直徑≥18mm 時，注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠）5 000～10 000U 誘導排卵，注射后36h左右取卵。（4）ICSI：精液處理采用密度梯度離心法，卵母細胞經培養液充分洗滌后置受精液G-IVF（Vitrolife，瑞典）中預培養3h，用透明質酸酶消化顆粒細胞，將去除顆粒細胞的卵母細胞置G-IVF 培養液中預培養0.5h。在400倍放大倍數下挑選形態相對正常的精子，常規精子制動后行ICSI。（5）胚胎移植及妊娠判斷：按照Peter卵裂期胚胎評分系統評估第3天（D3）胚胎質量，Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級胚胎視為可用胚胎，Ⅰ級和Ⅱ級胚胎視為優質胚胎［6-7］。胚胎移植后2 周尿HCG 檢測陽性者為生化妊娠，移植后5周B 超檢查可見孕囊及胎心搏動者為臨床妊娠。

3.統計學分析：采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理，計量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為有統計學差異。

二、結果

1.Y 染色體AZFc區完全缺失患者的精子獲得情況：79例AZFc區完全缺失患者中，38例患者取到精子，精子獲得率為48.10%，其中手淫射精33例，占86.84%；睪丸穿刺2 例，占5.27%；顯微手術取精3例，占7.89%。

2.兩組患者一般情況比較：兩組患者平均年齡、女性配偶年齡、不育年限、精液濃度、基礎FSH值、基礎E2值、促排卵周期獲卵數、注射MⅡ卵數、移植日子宮內膜厚度、移植胚胎數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

3.兩組妊娠結局比較：兩組受精率（65.05%vs.70.07%）、卵裂率（97.34%vs.96.02%）、優胚率（44.81% vs.40.88%）、可 用 胚 胎 率（79.23%vs.78.45%）、種植率（39.13%vs.43.27%）、臨床妊娠率（51.85%vs.58.62%）、流產率（7.14%vs.5.88%）及異位妊娠率（0%vs.2.94%）比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

表1 兩組患者一般情況比較（±s）

表1 兩組患者一般情況比較（±s）

組 別 周期數 男方年齡（歲） 女方年齡（歲） 不育年限（年） 精液濃度（106／ml） 基礎FSH（U／L）研究組 27 31.26±4.02 28.77±3.55 3.74±2.52 3.81±1.45 6.44±1.65對照組 58 30.81±3.76 28.12±3.81 3.66±2.68 4.66±2.31 6.75±1.83組 別 周期數 基礎E2（pmol／L） 獲卵數（個） 注射MⅡ卵數（個） 內膜厚度（mm） 移植胚胎數（枚）研究組 27 145.74±68.17 13.22±4.52 10.56±5.78 11.28±2.41 1.81±0.42對照組 58 137.98±63.14 12.41±4.92 9.62±4.39 11.71±2.08 1.83±0.50

表2 兩組患者妊娠結局比較［n（%）］

三、討論

近年來，眾多研究表明男性不育的遺傳學病因主要包括基因突變、染色體畸變、單核苷酸多態性及Y 染色體微缺失，其中Y 染色體微缺失較為常見［8］，有研究表明中國男性不育患者中Y 染色體缺失率約為10.8%，其中無精子癥和嚴重少精子癥患者中缺失率分別為11.75%和8.51%［3］。Y 染色體長臂的AZF區是微缺失的高發區域，該區域的基因微缺失可引起不同程度的精子發生障礙，繼而導致男性不育。AZF區域存在4個亞區，分別為AZFa、AZFb、AZFc和AZFd，不同區域的缺失所導致的臨床表現也各不相同：AZFa區微缺失，臨床表現一般為無精子癥，伴隨睪丸體積稍小；AZFb區微缺失，生精過程阻滯在精母細胞階段，亦無精子生成；AZFc區微缺失，表現為偶見少量的活動精子，其中精子畸形數量明顯增多；AZFd區微缺失，表現為輕度少精子癥或精子數量正常，但形態異常［9-10］。

國內外研究報道的Y 染色體微缺失主要發生在AZFc區，約占總缺失的60%［11］。我們先前的研究對616名無精子癥和重度少精子癥患者進行Y染色體微缺失檢測，其中AZFc 區缺失率為60.9%［12］，和 文 獻［11］報 道 基 本 一 致。隨 著 精 子 獲取技術和ICSI技術的發展，一部分AZFc區完全缺失的患者可以獲得精子并通過ICSI技術使女性配偶受孕成功，Choi等［13］在研究中對21 名AZFc區完全缺失的無精子癥患者進行睪丸穿刺，其中8名患者獲得了滿足ICSI操作質量標準的精子，精子獲得率為38%。本研究中我們對79名AZFc區完全缺失的患者進行取精，其中38名患者獲得精子，獲得率（48.1%）高于Choi等的研究，且大部分患者是手淫射精，這可能與該79名患者中無精子癥患者所占比率較少有關系，該79例患者大部分為嚴重少精子癥。Liu等［4］比較了AZFc區完全缺失和無Y 染色體缺失患者的ICSI結局，發現AZFc區完全缺失會降低受精率，但不影響妊娠率。吳畏等［14］選取Y染色體微缺失的患者48例56個周期和同期治療的未發現Y 染色體微缺失的嚴重少弱精子或無精子癥患者90 例94個周期，兩組妊娠率分別為37.5%和35.1%，差異并無統計學意義。

本研究比較了AZFc區完全缺失患者和無Y染色體微缺失的無精子癥和嚴重少精子癥患者的受精率、卵裂率、優胚率、可用胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產率及異位妊娠率等，結果表明兩組間差異均無統計學意義，提示Y 染色體AZFc區完全缺失可能并不影響ICSI的妊娠結局。已有研究表明AZFc區缺失會遺傳給男性后代，但女性后代不孕的風險通常不會增加，患者可以選擇進行種植前遺傳學診斷（PGD），選擇女胚進行移植［15］。由于Y 染色體AZFc區完全缺失行ICSI治療的病例資料仍然有限，分析結果可能存在一定的片面性，因此之后的研究應進一步積累資料，擴大樣本量進行深入探討。

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