大理蒼山兩條溪流中水生絲孢菌資源調查及比較

劉曉英，羅宗龍，李琴艷，王如瀟，陶星辰，王立偉，蘇鴻雁*

（1.大理學院基礎醫學院，云南大理　671000；2.大理學院農學與生物科學學院，云南大理　671003）

大理蒼山兩條溪流中水生絲孢菌資源調查及比較

劉曉英1，羅宗龍2，李琴艷2，王如瀟1，陶星辰1，王立偉2，蘇鴻雁2*

（1.大理學院基礎醫學院，云南大理671000；2.大理學院農學與生物科學學院，云南大理671003）

［摘要］目的：調查黑龍溪和萬花溪水生真菌資源，比較其差異性。方法：2013年3月份從黑龍溪和萬花溪中各采集沉水腐木50份，采用保濕培養法對水生真菌進行培養，基于形態學特征對水生真菌進行鑒定。結果：共分離鑒定出48種水生絲孢菌，萬花溪30種，黑龍溪21種，Kostermansinda nanum、Phaeoisaria clematidis和Sporidesmiella rosae在兩條溪中都有出現。結論：黑龍溪和萬花溪中水生真菌資源豐富，人工建壩對真菌群落有影響。

［關鍵詞］水生真菌；資源；調查；沉水腐木

［DOI］10.3969/j.issn.1672-2345.2015.06.015

水生真菌在生態系統中具有非常重要的作用〔1〕。據估計，全球約有1.5億種真菌〔2〕，但已發現的真菌只占5%，大約7萬種，且多數為陸地真菌〔3〕。盡管從上個世紀40年代開始就有水生真菌的報道，但與陸地真菌相比較，對這一類群真菌的多樣性仍然知之甚少〔4〕。直到2007年，大約3 000種真菌報道于水環境〔5-6〕。對水生真菌的研究主要集中于歐洲、北美洲及東南亞地區〔7〕，世界上仍有很多地區，例如中國大陸、非洲、南美洲、澳大利亞、北極地區以及全球范圍內的熱帶地區的水生真菌研究工作有待加強〔5〕。在熱帶和亞熱帶地區，已經有許多水生真菌報道于河流或小溪，如香港〔8〕、昆士蘭北部、澳大利亞和塞舌爾〔9-10〕。在溫帶地區尤其是美國和英國〔11-13〕也有相應報道。

云南具有復雜的氣候和自然環境，20世紀80年代楊發蓉和丁樺孫對滇池〔14〕、洱海〔15〕、長湖〔16〕等地的水生真菌進行過研究，但其研究對象基本是低等水生真菌。2000年，云南大學研究人員開始在云南不同地域對水生真菌群落多樣性及其生態學方面進行了系統性研究〔17-21〕。迄今為止，未見關于大理蒼山十八溪水生絲孢菌的研究報道。本項目對蒼山黑龍溪和萬花溪中沉水腐木上的水生絲孢菌資源進行調查，并進行比較分析，所得結果將為后續研究提供數據支持。

1　材料與方法

1.1樣品采集蒼山位于大理州中部，呈南北走向，地跨東經99°54′30′′～100°12′12′′、北緯25°33′30′′～25°59′48′′，最高點海拔4 122 m，萬花溪和黑龍溪分別為蒼山東坡十八溪中由北往南的第二溪和第十四溪〔22〕。2013年3月份，分別沿黑龍溪和萬花溪岸邊，由下游往上游各隨機采集樣品50份。采集的樣品為長期浸泡在溪水中的腐木，腐爛程度一般通過肉眼即可判斷，采集時盡量選擇表皮脫落，指甲掐壓時松軟的木頭。腐木大小以直徑1～5 cm，長20～30 cm為宜。采集到的樣品裝入自封袋中帶回實驗室進行保濕培養。

1.2培養基PDA培養基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水加至1 000 mL。

WA培養基：瓊脂18 g，蒸餾水加至1 000 mL。MEA培養基：麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，瓊脂18 g，蒸餾水加至1 000 mL。以上培養基經高壓蒸汽滅菌（121℃，20 min），待其冷卻至50℃以下加入氨芐青霉素，終濃度為100 μg/mL，倒入無菌平板中備用。

1.3樣品處理將采集回來的樣品按地點編號后放入用酒精消毒后的封閉塑料盒中，盒底鋪上滅菌的吸水紙用于保濕，吸水紙上再放上滅菌吸管適當隔離，噴灑適量無菌水，室溫條件下進行培養，一周后開始觀察。在體視鏡下觀察到真菌子實體后，用大頭針標記出觀察到的區域，再用解剖針挑出目的真菌制成水玻片，在OLYMPUS BX51顯微鏡下觀察并使用Image-Pro Express C軟件拍照并測量。采用單孢分離技術，在無菌操作臺中將孢子用無菌解剖針或削尖的牙簽轉接到事先準備好的PDA平板中，室溫培養24 h后觀察萌發，待其萌發后挑取一到兩個孢子制片并在顯微鏡下觀察并拍照，平板上其余孢子單個轉移到新的PDA或MEA上，室溫培養觀察菌落形態。干標本及純培養一式三份進行保存。

1.4水生絲孢菌鑒定查找相關文獻〔23-25〕，根據分生孢子梗和產孢細胞的形態特征以及分生孢子的形成方式、大小、形狀、顏色、分隔、附屬物、內部有無油滴狀內含物等特征將其鑒定到屬、種。

1.5水生絲孢菌統計

水生絲孢菌出現頻率（%）=（某個種出現次數/樣品總數）×100%

比較黑龍溪和萬花溪中水生真菌物種組成相似性，采用辛普森相似指數（S）進行比較〔26〕。

S=2c/（a+b），其中，a=黑龍溪中的水生絲孢菌種數，b=萬花溪中的水生絲孢菌種數，c=在兩條溪中都有的水生絲孢菌種數，S=0表示不相似，S=1表示完全相似。

采用香農-威納指數（H）來反映黑龍溪和萬花溪中水生絲孢菌多樣性〔21〕。

其中，Ni=第i個種的檢出次數，N=所有種的檢出次數，lnpi=pi的自然對數。

2　結果

在黑龍溪和萬花溪中采集并鑒定出水生絲孢菌共48種，其中黑龍溪30種，萬花溪21種，見表1。從形態上初步鑒定出13個可能的新種（在表1中以屬名+sp.表示），還需進一步采用分子生物學技術來確定這些新種的分類地位。黑龍溪中常見種為Helico?sporiumguianense、Sporidesmium adscendens、Hel?minthosporium velutinum。萬花溪中常見種為Helico?myces tenuis、Phaeoisaria clematidis、Monodictys moni?licellularis。兩條溪共有的種只有3個，分別是Kos?termansinda nanum、P.clematidis、Sporidesmiella ro?sae，而且他們出現的頻率也不一樣。通過計算得出黑龍溪和萬花溪中水生真菌物種組成的相似指數為0.12（見表1），說明這兩條溪中水生絲孢菌具有較大差異。黑龍溪和萬花溪中水生絲孢菌的香農-威納指數（H）分別為3.67和2.22（見表1），表明黑龍溪中的水生絲孢菌多樣性明顯高于萬花溪中的水生絲孢菌多樣性。

表1　黑龍溪和萬花溪中沉水腐木上水生絲孢菌出現頻率

續表

3　討論

Shearer等〔5〕在2007年預測淡水中有大量的真菌有待發現，本次研究選取蒼山十八溪中的兩條溪進行研究，發現了13個可能的新種，與這一預測相符；從調查結果可知，黑龍溪和萬花溪中水生絲孢菌資源豐富，其中以K.nanum、P.clematidis和S.rosae為常見種，蒼山另外十六條溪中的水生真菌還有待研究。

黑龍溪和萬花溪中真菌群落差異性較大，萬花溪中的水生絲孢菌的多樣性低于黑龍溪中的水生真菌多樣性。影響淡水生境中水生絲孢菌群落及多樣性的因素有很多，主要包括：生境、水質、水污染、真菌生長基質、地理氣候條件、岸邊植被等〔21〕。水生真菌的淡水生境一般分3種類型：靜態生境（如湖泊、池塘、水池、沼澤地等）、動態生境（如河流、溪流等）和人工生境（如冷水塔、人工水庫等）〔27〕。本研究選取的黑龍溪和萬花溪皆屬于動態生境，淡水生境一致。馬根連于2012年對蒼山十八溪水質進行監測評價，其中萬花溪和黑龍溪出山口水質均為Ⅱ類〔28〕，可認為兩條溪流水質基本相同。兩條溪相距19 km左右，地理氣候條件差異不大，岸邊植被種類也類似，在采集沉水腐木過程中皆是隨機采集，因此，兩條溪流的地理氣候條件、岸邊植被、真菌生長基質的差異不大。萬花溪水電站于1960年建成，在萬花溪上游修建了蓄水大壩，大壩附近植被遭到破壞，截流蓄水導致萬花溪下游出現斷流現象，進而影響水生真菌的生存環境。本研究認為兩條溪真菌群落差異較大并且萬花溪中的水生絲孢菌的多樣性低于黑龍溪中的水生真菌多樣性的主要原因是修建了蓄水大壩，這一結論與胡殿明〔21〕所持觀點相同。

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（責任編輯毛本勇）

［中圖分類號］Q948

［文獻標志碼］A

［文章編號］1672-2345（2015）06-0058-04

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（31360013；31460015）；云南省中青年學術帶頭人資助項目（2012HB-042）；云南省高校滇西生物多樣性科技創新團隊基金資助項目（云教函〔2011〕93號）；大理學院質量工程項目（TDI-05）

［收稿日期］2015-03-30［修回日期］2015-04-14

［作者簡介］劉曉英，碩士研究生，主要從事微生物及疾病研究.

*通信作者：蘇鴻雁，教授.

Investigation and Comparison of Freshwater Hyphomycetes between Two Streams in Cangshan Mountain in Dali

Liu Xiaoying1，Luo Zonglong2，Li Qinyan2，Wang Ruxiao1，Tao Xingchen1，Wang Liwei2，Su Hongyan2*
（1.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Agriculture and Biology Science，Dali University，Dali，Yunnan 671003，China）

〔Abstract〕Objective：To find out the resources of freshwater hyphomycetes from Heilong Stream and Wanhua Stream and compare their differences.Methods：50 samples were collected from each stream，using Moist Incubation Method to incubate the fungi，identifying the fungi based on the morphological characters.Results：48 species of freshwater hyphomycetes were find out with 30 species from Heilong Stream and 21 species from Wanhua Stream.Kostermansinda nanum，Phaeoisaria clematidis and Sporidesmiella rosae were found from both streams.Conclusion：The resources of freshwater hyphomycetes are abundant in Heilong Stream and Wanhua Stream，and artificial dam can affect the communities of freshwater fungi.

〔Key words〕freshwater fungi；resources；investigation；submerged decayed wood