虎源金黃色葡萄球菌耐藥性的檢測及耐β—內酰胺類藥機制的研究

萬蝶　吳長德

摘 要：金黃色葡萄球菌在自然界中的分布極其廣泛，存在于空氣、水和土壤中，寄居在人和動物的皮膚黏膜、鼻腔、咽喉以及胃腸道等處，是臨床上常見的致病菌之一。由于其可以產生溶血毒素、腸毒素、血漿凝固酶、耐熱核酸酶等，在臨床可引起各種家畜的呼吸道感染、子宮內膜炎、外傷化膿、乳房炎，若治療不及時會引起敗血癥而導致死亡。近些年，隨著抗生素的廣泛應用，目前臨床分離的金黃色葡萄球菌耐藥現象非常嚴重，而且出現多重耐藥現象，這給臨床治療帶來極大的困難，金黃色葡萄球菌的耐藥問題已經引起人們的極大關注。

東北虎作為世界一級保護動物，近年來時有病原微生物感染死亡的報道。本研究旨在研究虎源金黃色葡萄球菌對常用抗菌藥物的耐藥性，并通過對相關耐藥基因的檢測，分析其耐藥機制，為今后指導臨床合理使用抗生素防控野生動物金黃色葡萄球菌感染提供理論依據。

關鍵詞：虎；金黃色葡萄球菌；耐藥性；耐藥機制

本實驗采集病死東北虎的化膿性腎臟，通過細菌的分離培養、純化，染色、鏡檢以及PCR方法進行鑒定；以金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc）為靶基因，選擇特異性引物進行PCR擴增，用來鑒定金黃色葡萄球菌；采用紙片擴散法測定分離菌株對常用抗菌藥物的敏感性，分析其耐藥性；液體培養分離菌株，提取細菌DNA，根據藥敏實驗的結果，針對相應的耐藥基因設計引物，通過PCR方法對相關耐藥基因進行擴增、測序，分析其耐藥機制。

1 虎源金黃色葡萄球菌的分離與鑒定

1.1 實驗方法

1.1.1 金黃色葡萄球菌的分離培養 將沈陽森林野生動物園的病死東北虎腎臟及時帶回實驗室。切取平整病料，在瓊脂平板上劃板，于37℃恒溫培養箱中培養24小時，將可疑菌落涂片染色鏡檢，并繼續劃板，進行純化培養。若確定為金黃色葡萄球菌，則需挑取菌落于營養肉湯培養基中，震蕩混勻后放入37℃恒溫培養箱中，培養8小時后，置于30%甘油保存備用。

1.1.2 金黃色葡萄球菌的鑒定 形態鑒定和革蘭氏染色鏡檢；并提取細菌基因組DNA，設計、合成金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因nuc引物，利用PCR鑒定金黃色葡萄球菌，并經瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物大小。

反應條件：94℃預變性3min；94℃變性30S，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環；72℃延伸10min結束反應，產物于4℃保存。

1.2 實驗結果

1.2.1 形態鑒定結果 在普通營養瓊脂上形成灰白色、濕潤、隆起、表面光滑的菌落（圖1）。

1.2.2 染色結果 對分離菌進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察，可見葡萄串狀排列的革蘭氏陽性球菌，無鞭毛、無莢膜、無芽孢，可初步判定為葡萄球菌（圖2）。

1.2.3 耐熱核酸酶基因檢測結果 提取菌株基因組DNA為模板，對nuc基因進行PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在250bp附近出現單一清晰的目的條帶，擴增產物片段大小與預期目的片段相符，為279bp（圖3）。

1.2.4 nuc基因測序比對結果 將PCR產物的測序結果與NCBI上收錄的基因進行比對，同源性為99%，確定擴增產物為nuc基因。

2 金黃色葡萄球菌體外藥物敏感性實驗

2.1 實驗材料

營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基。

2.2 抗菌藥物

藥敏紙片；β-內酰胺類：阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟；氨基糖苷類：阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素；大環內脂類：紅霉素、克林霉素、阿奇霉素；喹諾酮類：恩諾沙星、環丙氟哌酸；四環素類：四環素、強力霉素；氯霉素類：氯霉素、氟苯尼考；糖肽類：萬古霉素；共計7大類16種。

2.3 實驗方法

2.3.1 將菌株活化 -80℃備用的金黃色葡萄球菌菌株在營養肉湯培養基上活化培養48小時。

2.3.2 增殖培養 從增殖菌液中取15微升放入20毫升營養肉湯后，放置在恒溫培養箱中培養。

2.3.3 對菌濃度的測定 以營養肉湯為空白對照，不同生長階段的菌液為樣品，用分光光度計測定其OD值，OD600的數值范圍在0.6左右時為對數生長期（約培養8小時），此時適合做藥敏實驗。

2.3.4 藥敏實驗 將菌液均勻涂布于培養基平板上，用鑷子夾取藥敏片貼在培養基平板上。每種藥物貼3次藥敏片，將培養基平板放入37℃恒溫箱，16～18小時后觀察結果。參照CLSI（2012）公布的三種形式：敏感（Susceptible）、中介（Intermediate）、耐藥（Resistant），對抑菌圈大小的標準作出判定。個別使用藥物CLSI（2012）沒有列出，按杭州天和微生物試劑有限公司提供的標準進行解釋。

2.4 實驗結果

觀察體外藥物敏感性實驗的抑菌環，并用游標卡尺測量抑菌環直徑的大小，記錄結果（圖4）。

從表3可以看出，金黃色葡萄球菌分離菌株對阿米卡星、紅霉素、克林霉素、阿奇霉素、恩諾沙星、環丙氟哌酸、四環素、強力霉素、氟苯尼考和慶大霉素表現出敏感的狀態；對氯霉素和萬古霉素表現出中介的狀態；對β-內酰胺類藥的阿莫西林、氨芐西林和頭孢噻肟表現出耐藥的狀態。

3 虎源金黃色葡萄球菌對β-內酰胺類藥耐基因的檢測

3.1 實驗方法

3.1.1 引物設計 提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，并設計合成β-內酰胺類藥物耐藥基因PCR擴增引物（表4）。

3.1.2 β-內酰胺類藥物4種耐藥基因的檢測 以金黃色葡萄球菌基因組為模板，對mecA、femA、TEM、SHV等4種基因進行PCR擴增檢測，反應體系為30微升（表5）。

反應條件：95℃預變性3分鐘，95℃變性30秒，退火30秒，擴增mecA退火溫度為57℃，擴增femA的退火溫度為55℃，擴增TEM的退火溫度為55℃，擴增SHV的退火溫度為60℃，72℃延伸1分鐘，從第二步起共35個循環，最后72℃延伸10分鐘結束反應，產物于4℃保存。

3.1.3 瓊脂糖凝膠電泳 取5微升PCR擴增產物加入1.5%瓊脂糖凝膠中，120V電泳30分鐘，選用DL-2000 DNA Marker分子量標準，用凝膠成像系統拍照分析。

3.1.4 PCR產物測序 將膠回收的PCR產物直接測序，測序結果利用DNAMAN軟件進行序列分析，并與GenBank上收錄的序列進行比對和分析。

3.2 實驗結果

3.2.1 PCR擴增結果 TEM基因PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，紫外光觀察，顯示擴增獲得約309 bp的特異性條帶，與預期片段長度相符（圖5）。

SHV基因PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，紫外光觀察，顯示擴增得到約176bp的特異性條帶，與預期片段長度相符（圖6）。

3.2.2 測序結果 將SHV基因測序結果與NCBI上收錄的SHV基因序列（blaSHV-154，gb|JX121121.1|）進行比對，同源性為97%，可以確定擴增基因為SHV基因。

將TEM基因測序結果與NCBI上收錄的TEM基因序列（TEM，gb|KF963580.1|）進行比對，同源性為99%?？梢源_定擴增的基因為TEM基因。

4 結論

從死亡東北虎的腎臟成功分離出金黃色葡萄球菌；該分離菌株對β-內酰胺類藥物：頭孢噻肟、阿莫西林和氨芐西林等耐藥；對四環素、克林霉素、強力霉素、阿米卡星、紅霉素、恩諾沙星、慶大霉素、阿奇霉素、鏈霉素、環丙氟哌酸等高度敏感，對氯霉素和萬古霉素中度敏感；從分離菌株中PCR擴增出TEM、SHV耐藥基因，說明產β-內酰胺酶是導致虎源金黃色葡萄球菌對頭孢噻肟、阿莫西林等β-內酰胺類抗生素產生耐藥的分子機制。