前列腺小體外泌蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立和初步評(píng)價(jià)＊

曾燕，張嬌，陳艷華，孟潔，劉振興，宋華，徐軍，胡成進(jìn)，陸群

前列腺小體外泌蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立和初步評(píng)價(jià)＊

曾燕，張嬌，陳艷華，孟潔，劉振興，宋華，徐軍，胡成進(jìn)＊，陸群

目的建立前列腺小體外泌蛋白ELISA檢測(cè)方法并評(píng)價(jià)其作為慢性前列腺炎輔助診斷的可行性。方法從慢性前列腺炎患者尿液中提取并純化前列腺小體外泌蛋白，以純化的前列腺小體外泌蛋白為抗原免疫實(shí)驗(yàn)BALB/c小鼠，得到單克隆抗體經(jīng)過(guò)純化后，建立ELISA檢測(cè)方法。并對(duì)筆者所在醫(yī)院的140例慢性前列腺炎患者尿液及正常人60例尿液中的前列腺小體外泌蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)。通過(guò)正交試驗(yàn)確定特異性抗體和酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度，并對(duì)試劑盒進(jìn)行了4℃，12個(gè)月保存實(shí)驗(yàn)。確定該檢測(cè)方法的臨界值。結(jié)果慢性前列腺炎癥患者尿液中前列腺小體外泌蛋白含量明顯高于正常人尿液中含量，有顯著性差異（Z=10.74，P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)室臨界值為1.24 ng/ml。在140份慢性前列腺炎患者尿樣中，陽(yáng)性率為88.5%；特異性為90%。將前列腺小體外泌蛋白試劑盒測(cè)定結(jié)果與臨床金標(biāo)準(zhǔn)比較［Kappa=0.75（95%CI=0.652 to 0.848），P＜0.01］，該檢測(cè)試劑盒與臨床金標(biāo)準(zhǔn)有高度一致性。試劑盒各個(gè)成分在低溫保存12個(gè)月可以保持穩(wěn)定。結(jié)論前列腺小體外泌蛋白的檢測(cè)試劑盒靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性合格，可以為臨床前列腺炎診斷提供可靠的依據(jù)。

前列腺小體外泌蛋白；ELISA檢測(cè)方法；評(píng)價(jià)

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）是泌尿外科中青年男性患者最常見(jiàn)的疾病之一，據(jù)報(bào)道其占門(mén)診量的30%。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國(guó)成人男性人群中，10%以上有前列腺炎樣癥狀，50%男性不同時(shí)期均患過(guò)前列腺炎［1］。在前列腺癌中，炎癥的存在及細(xì)胞上皮組織損傷后再生被認(rèn)為是惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。文獻(xiàn)指出，大約12%前列腺炎如不及時(shí)治療可轉(zhuǎn)化為前列腺癌。所以前列腺炎嚴(yán)重影響男性健康［2-4］。前列腺炎臨床表現(xiàn)因患者個(gè)體差異而缺乏特異性，因此在臨床上治療效果一直不滿意。根據(jù)1997年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）對(duì)前列腺炎的分類(lèi)，臨床上通常以Ⅲ型慢性前列腺炎多見(jiàn)，約占90%左右。在臨床實(shí)際工作中，泌尿男科醫(yī)師對(duì)首診的CP患者選擇的檢查方法前3位的是尿液分析、前列腺液檢查、直腸指檢。前列腺液檢查和直腸指檢對(duì)患者有一定侵入性，因此非常需要簡(jiǎn)便無(wú)侵入性，同時(shí)準(zhǔn)確可靠的分子診斷方法［5］。

前列腺小體（prostasomes）是由人類(lèi)前列腺上皮細(xì)胞分泌的一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，平均直徑150 nm，存在于前列腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞頂部富含高爾基體的地方，由前列腺導(dǎo)管上皮通過(guò)胞吐作用和胞透作用分泌至管腔［6，7］。Alba Minelli等在前列腺疾病患者血清中檢測(cè)到前列腺小體［8］。本文提供一種基于前列腺小體外泌蛋白定量的間接酶聯(lián)免疫吸附方法，作為前列腺炎輔助診斷，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料按照《中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南》中前列腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，2012年—2013年從濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院收集慢性前列腺炎140例。年齡16～72歲，平均34歲。正常人體檢尿液60份，年齡20～68歲，平均34歲。尿常規(guī)均正常。尿液收取后立即檢測(cè)，或放-20℃冰箱保存。2個(gè)月之內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.2試劑和儀器前列腺小體外泌蛋白和特異性鼠抗人前列腺小體外泌蛋白檢測(cè)抗體由美國(guó)EliOnco公司提供。96孔聚苯乙烯檢查板由美國(guó)Becton-Dickson及美國(guó)Thomas Fisher Scientific提供。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自Sigma公司。自配清洗液、顯色劑、終止液。清洗液為含0.5%吐溫-20 的PBS溶液；顯色劑A含檸檬酸、乙酸鈉、過(guò)氧化脲；顯色劑B含檸檬酸、EDTA、TMB鹽酸鹽、硫代硫酸鈉溶液；終止液為2 mol/L H2SO4。

DEM-Ⅲ自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)，采用北京拓普分析儀器有限公司。酶標(biāo)儀（680型）購(gòu)自BIO-RAD公司。WHS型智能恒濕恒溫箱，購(gòu)自寧波江南儀器廠。微量移液器，采用Eppendorf，Gilson品牌。

1.3ELISA檢測(cè)方法建立將稀釋為一定比例的前列腺小體外泌蛋白標(biāo)準(zhǔn)品包被在96孔板中（B1-F1孔），其余孔加尿液標(biāo)本，37℃恒溫箱孵育1 h，洗板機(jī)洗板5次后，加1%BSA封閉，每孔100微升，37℃恒溫箱孵育40 min，洗板5次。加入特異性前列腺小體外泌蛋白檢測(cè)抗體，37℃恒溫箱孵育40 min，洗板后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃恒溫箱孵育20 min，洗板后避光顯色20 min，加入終止液，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定各反應(yīng)孔在雙波450，630 nm處的OD值。根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將患者的數(shù)值與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)孔數(shù)值比較，從而得出被測(cè)試者尿樣本的實(shí)際前列腺小體外泌蛋白濃度。

樣本檢測(cè)：用間接ELISA方法檢測(cè)140例前列腺炎癥和60例正常人尿樣本。根據(jù)臨床樣本檢測(cè)真陽(yáng)性a，假陽(yáng)性b，假陰性c，真陰性d，求出檢測(cè)靈敏度，特異度，陽(yáng)性預(yù)期值，陰性預(yù)期值并計(jì)算Cutoff值。

1.4方法學(xué)鑒定

1.4.1分析精密度批內(nèi)變異：用兩個(gè)濃度水平的樣本（炎癥和正常人）各重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算10次測(cè)量濃度結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，得出變異系數(shù)CV。批間差：用3個(gè)批號(hào)的試劑盒分別檢測(cè)同樣兩份標(biāo)本，各重復(fù)10次，計(jì)算30次結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，求出變異系數(shù)CV。

1.4.2各組成部分的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)酶聯(lián)板，特異性抗體，酶標(biāo)抗體，顯色劑，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品等各組成部分放入4℃冰箱，檢測(cè)1次/m，觀察有效期限。1.4.3正交實(shí)驗(yàn)把特異性結(jié)合抗體按照1∶50；1∶100稀釋?zhuān)幻笜?biāo)抗體按照1∶2000；1∶2500；1∶3000；1∶5000稀釋?zhuān)缓笙燃訕颖?7℃孵育1 h，洗板封閉后，加不同濃度的特異性抗體后，37℃孵育40 min，洗板5次后加入不同濃度的酶標(biāo)抗體，37℃孵育20 min后，洗板顯色。根據(jù)OD值數(shù)據(jù)選出最佳的特異抗體和酶標(biāo)抗體的使用濃度。

1.4.4檢測(cè)方法比較（ELISA雙抗夾心法和間接法）檢測(cè)方法的確定對(duì)于檢測(cè)效果具有至關(guān)重要的作用，在確定了抗體和試劑及測(cè)試時(shí)間以后必須對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行篩選，然后比較了雙抗夾心法和間接法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。前列腺炎癥患者與正常人的樣本差異比較采用秩和檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1臨床樣本檢測(cè)結(jié)果前列腺炎癥患者尿樣和正常人尿樣本PESP檢測(cè)，炎癥患者尿液中前列腺小體外泌蛋白含量與正常人相比較明顯升高，有顯著性差異［（3.013±2.199）ng/ml vs（0.734±0.574）ng/ ml，Z=10.74，P＜0.05］。

2.2方法學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1靈敏度、特異度、符合率評(píng)價(jià)按方案要求對(duì)200例樣本進(jìn)行臨床金標(biāo)準(zhǔn)和考核試劑的兩種檢測(cè)。計(jì)算前列腺小體外泄蛋白檢測(cè)試劑盒臨床檢測(cè)的靈敏度、特異性、總符合率、陽(yáng)性預(yù)期值、陰性預(yù)期值等統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。根據(jù)臨床金標(biāo)準(zhǔn)選擇慢性前列腺炎140例，正常對(duì)照40名，用本試劑盒在140例炎癥患者中檢出陽(yáng)性124例，陰性16例。在正常對(duì)照60名中，陽(yáng)性16名，陰性44名。

靈敏度=a/（a+c）×100%=124/140×100%=88.5%；特異度=d/（b+d）×100%=54/60×100%=90%；總符合率=（a+d）/（a+b+c+d）=（124+54）/200×100%=89%。2.2.2一致性分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)前列腺小體外泌蛋白檢測(cè)試劑盒和臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示Kappa=0.75（95%CI= 0.652 to 0.848），P＜0.01，一致性具有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.3準(zhǔn)確性檢驗(yàn)（ROC曲線分析）評(píng)價(jià)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)前列腺小體外泌蛋白試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行ROC曲線擬合，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　前列腺小體外泌蛋白的ROC曲線

如圖1所示，ROC曲線下面積為0.963（SE= 0.0125，95%CI 0.927～0.985，Z=36.948，P＜0.01），表示前列腺小體外泌蛋白試劑盒對(duì)慢性前列腺炎具有較好的診斷價(jià)值。選擇Youden指數(shù)最大的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的界值作為慢性前列腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，得出前列腺小體外泌蛋白的診斷點(diǎn)為1.24 ng。

2.2.4精密度分析用兩個(gè)濃度水平的樣本（陽(yáng)性和陰性）各重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算10次測(cè)量濃度結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，得出變異系數(shù)CV＜8%。用3個(gè)批號(hào)的試劑盒分別檢測(cè)同樣兩份標(biāo)本，（陽(yáng)性和陰性）各重復(fù)10次，計(jì)算30次結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，其變異系數(shù)CV為10.1%。結(jié)果見(jiàn)表1。從以下數(shù)據(jù)可以看出該試劑盒反應(yīng)體系具有良好的精密度。

表1　反應(yīng)體系的精密度檢測(cè)

表2　試劑盒4℃保存實(shí)驗(yàn)

2.2.5試劑盒保存的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)試劑盒置4℃條件下干燥保存，每月定期抽檢直至12個(gè)月，檢測(cè)前列腺炎陽(yáng)性樣本和正常人樣本。結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)1～12月，陽(yáng)性樣本ng值每月無(wú)明顯降低，陰性樣本數(shù)值穩(wěn)定，均在1 ng以下。P/N＞4.7。各個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)品曲線R2值都在0.99以上，非常接近1。在保存12個(gè)月后，陽(yáng)性樣本ng值依然達(dá)到正常情況的90%。說(shuō)明試劑盒各個(gè)成分在低溫保存12個(gè)月可以保持穩(wěn)定。

3　討論

慢性前列腺炎中組織受到炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而釋放出各種活性物質(zhì)和趨化因子，一種稱(chēng)為前列腺小體的外泌蛋白通過(guò)解剖通道分泌進(jìn)入男性生殖道。研究提示，前列腺疾病中可能存在表達(dá)前列腺小體蛋白質(zhì)組的獨(dú)特表型，已知的分子功能是多種多樣的，包括結(jié)構(gòu)膜蛋白、酶、監(jiān)管蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等［9］。慢性前列腺炎病程中，多種致病因子啟動(dòng)Wnt途徑，Wnt信號(hào)通路異常表達(dá)，相應(yīng)下游活性物質(zhì)增加，與前列腺小體的釋放和表型的變化均有密切的關(guān)系［6］。高濃度的前列腺小體可以在精液、前列腺液中發(fā)現(xiàn)，電鏡下有兩種形態(tài)：小、黑色的，外面緊包電子致密物；大的，淺色的，不致密的結(jié)構(gòu)，直徑40～500 nm。有脂質(zhì)雙層膜，多層融合排列，富含膽固醇。相似的結(jié)構(gòu)也可以在前列腺細(xì)胞系的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)。前列腺小體的主要成分是鞘磷脂，含有磷酸膽堿和神經(jīng)酰胺。膽固醇和磷脂的比例是2∶1，而典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的此種比例是1∶1［10-13］。前列腺小體蛋白有多重生理功能。抑制PMN中NADPH氧化酶的活性，從而起到抗菌抗氧化作用［14，15］。在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件下，小劑量的前列腺小體呈現(xiàn)出對(duì)肺炎球菌、地衣形桿菌、側(cè)孢桿菌、Megatenium桿菌的強(qiáng)烈抑制作用，這種抗菌活性與細(xì)胞膜的變性密切相關(guān)。在掃描電鏡下，可直接觀察到前列腺小體黏附到光滑的細(xì)菌包膜表面，是其外觀逐漸變粗破裂，引起細(xì)菌死亡。

在精液中前列腺小體比中性粒細(xì)胞發(fā)揮更強(qiáng)的抗菌功能。前列腺小體可作為強(qiáng)有力的抗氧化劑，中和白細(xì)胞的ROS作用。前列腺小體的特殊的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分是其抗氧化抗菌功能的關(guān)鍵因素，推測(cè)在炎癥的過(guò)程中可以檢測(cè)到前列腺小體，同時(shí)此研究為開(kāi)發(fā)新類(lèi)型的抗菌藥物提供了理論基礎(chǔ)［16］。根據(jù)在炎癥狀態(tài)下前列腺小體外泄蛋白質(zhì)組的獨(dú)特表型，設(shè)計(jì)特異性抗體，僅僅通過(guò)尿液檢測(cè)，就能達(dá)到對(duì)慢性前列腺炎的早期明確診斷的目的。

從本檢測(cè)的200例尿樣中，可以看出前列腺炎患者和對(duì)照組正常人尿液中前列腺小體外泌蛋白含量的分布存在顯著性差異，患者樣本檢測(cè)到的前列腺小體外泌蛋白的濃度明顯高于對(duì)照組中前列腺小體外泌蛋白的濃度。其靈敏度為88.5%；特異度為90%，總符合率達(dá)到89%。并且臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)與本檢測(cè)結(jié)果相比有很好的一致性。

前列腺小體外泌蛋白外泌蛋白的檢測(cè)可以為臨床前列腺炎診斷提供一個(gè)可靠的檢測(cè)方法。同時(shí)該試劑盒經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的4℃條件下長(zhǎng)時(shí)間保存實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，符合國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局體外診斷試劑考核標(biāo)準(zhǔn)。此檢測(cè)方法簡(jiǎn)便可靠，適用于臨床慢性前列腺炎的輔助診斷。

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［本文編輯：吳蓉］

Establishment of ELISA detection method for prostatic exosomal protein，and its primary evaluation

ZENG Yan①，ZHANG Jiao，CHEN Yan-hua，et al.①Onco Biomedical Technology Suzhou CO.，Ltd.，Taicang，Jiangsu 215414，China

ObjectiveTo shape ELISA detection method for prostatic exosomal protein［PESP］and to evaluate the method of applying indirect ELISA for the assistant diagnosis of chronic prostatitis in its feasibility. MethodsPEP was isolated from the urines of chronic prostatitis patients and used as the immunogen for generating mouse monoclonal antibodies；the purified antibodies were used to establish an indirect ELISA detection method to study 140 urine samples of chronic prostatitis patients and 60 normal control＇s urine samples collected from the department of urology in Jinan Military Greneral Hospital.The optimal dilution of specific antibody and secondary antibody were surveyed through the orthogonal trial.The kits stored at 4℃for 12 months were tested. Differences between two groups and critical value were evaluated by using SPSS 16.0 software.ResultsThe content of PESP in chronic prostatitis sample was much higher than the normal control samples，that had significant differences between the two groups（Z=10.74，P＜0.05）.The critical value in the laboratory is 1.24ng/ml. There were perfectly consistent compared with the results of PESP testing kits and clinical gold standard（Kappa= 0.75［95%CI=0.652 to 0.848］，P＜0.01）.The components of the prostasomes kits can be stabilized storing at 4℃for 12 months.ConclusionThe prostasomesELISA kits is specific，sensitive，stable，and may provide a simple rapidly and reliable method for clinic prostatitis diagnosis.

Prostasomes（prostatic exosomal protein，PESP）；Prostatic disease；Indirect ELISA

R697.33

A

［自然基金項(xiàng)目］NIH-CA111891［美］

215414江蘇太倉(cāng)昂科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司（曾燕，張嬌，孟潔，劉振興）；美國(guó)北卡羅來(lái)納州Brody醫(yī)學(xué)院解剖細(xì)胞系（陳艷華，陸群）；250031山東濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院泌尿外科（宋華），實(shí)驗(yàn)診斷科（徐軍，胡成進(jìn)）

胡成進(jìn)，Email：hcj6289@163.com