痛風性關節炎濕熱蘊結證大鼠模型建立的研究

尹明，向黎黎，熊輝*，曲良燁，齊新宇，周彪（.湖南中醫藥大學，湖南長沙4008；.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南長沙40005；.張仲景國醫院，河南南陽47000）

·基礎研究·

痛風性關節炎濕熱蘊結證大鼠模型建立的研究

尹明1，向黎黎1，熊輝2*，曲良燁3，齊新宇1，周彪1
（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南長沙410005；3.張仲景國醫院，河南南陽473000）

目的探究建立痛風性關節炎濕熱蘊結證大鼠模型的方法。方法選用健康成年SD雄性大鼠40只，按隨機法將大鼠分為4組：正常對照組（A組），痛風組（B組），濕熱組（C組），痛風加濕熱模型組（D組），每組10只。各組經不同的處理或造模后，觀察大鼠的一般狀態，用Bradford法檢測大鼠尿液水通道蛋白2（AQP2），放射免疫法檢測內皮素（ET）、降鈣素基因相關肽（CGRP），ELISA法定量測定熱休克蛋白70（HSP70），HE染色、光鏡下觀察大鼠踝關節滑膜組織、舌組織。結果一般狀態，C、D組符合濕熱證的表現，B、D組符合痛風性關節炎的表現。尿液AQP2：A、B組高于C組和D組（P＜0.05）。血漿ET：A組低于B、C、D組（P＜0.05），B組低于C、D組（P＜0.05），C組低于D組（P＜0.05）。血漿CGRP：A組高于B、C、D組（P＜0.05），B組低于C組和D組（P＜0.05），C組低于D組（P＜0.05）。血清HSP70：B、D組高于A、C組（P＜0.05）。結論在高脂高糖飲食+濕熱環境+關節腔注射藥物的復合干預下，可以成功復制痛風性關節炎濕熱蘊結證的大鼠動物模型。

痛風性關節炎；濕熱蘊結證；大鼠模型

〔Abstract〕Objective To explore the methods for building the gouty arthritis rat models with damp-heat syndrome. Methods 40 healthy adult SD male rats were divided into 4 groups:normal control group（group A），gout group（group B），damp-heat group（group C），gout with damp-heat group（group D），10 in each group.The general status of the rats was observed before and after establishment.The water rat urine protein channel 2（AQP2）was detected by Bradford method；the endothelin（ET）and calcitonin gene-related peptide（CGRP）were measured by radiation immune method.HSP70 was detected byELISAmethod.TheratsweredyedbyHE.Synovialandtonguetissuesofanklesinratswereobservedby light-microscopy.Results In the general status，group C and D showed the manifestations in hot and humid，group B and D were in accordance with the performance of gouty arthritis.Urine AQP2 in group A and B was higher than that in group C and D（P＜0.05）.The content of plasma ET in group A was lower than that in group B，C and D（P＜0.05），group B was lower than Group C and D，and group C was lower than group D（P＜0.05）.Plasma CGRP in group A was higher than that in group B，C and D（P＜0.05），group B is lower than group C and group D（P＜0.05），group C is lower than group D（P＜0.05）.Serum HSP70 in group B and D were higher than group A and C（P＜0.05）.Conclusion Under the comprehensive intervention of the high fat and sugar diet+damp-heat environment+articular cavity drug injection，the gouty arthritis rat models with damp-heat syndrome can be built successfully.

〔Keywords〕gouty arthritis；damp-heat syndrome；rat models

痛風（Gout）是體內嘌呤代謝紊亂導致的代謝性疾病，病因是尿酸鹽在關節及關節周圍組織中沉積，引起的急性炎癥反應［1］。在現今實驗研究中，單純痛風性關節炎模型及單純中醫濕熱證大鼠模型的研究較多，但痛風性關節炎“病”與中醫濕熱證“證”病證結合動物模型的研究較少，該病證結合動物模型的建立，成為亟待解決的問題。本課題采用對痛風性關節炎濕熱證單因素造模與多因素復合造模的大鼠模型對比研究的方法，探討建立痛風性關節炎濕熱證大鼠模型的可行性，現報道如下。

1　材料與方法

1.1動物

SPF級健康成年SD雄性大鼠40只，體質量（200±20）g，清潔級；由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證編號：SCXH（湘）2013-0004。

1.2試劑及儀器

1.2.1主要試劑微晶尿酸鈉（Sigma），氧嗪酸鉀（Sigma），吐溫80（Sigma）；紅星二鍋頭酒（酒精度為52度，北京紅星股份有限公司生產）；大鼠血清HSP70試劑盒（北京華埠力特生物技術研究所）；尿AQP2試劑盒（碧云天生物技術研究所）；油脂（自購），蜂蜜（湖南明園蜂業）；尿酸檢測試劑盒（比色法，德國羅氏診斷有限公司）。

1.2.2主要儀器QHX-300BS-Ⅲ人工氣候箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）；GC-1500r放射免疫計數器（科大創新股份有限公司中佳分公司）；WH-2微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；DNM-9602酶標分析儀（北京普林新技術有限公司）。

1.3方法

1.3.1試劑的制備參考Coderre等［2］介紹的方法進行改良。（1）尿酸鈉溶液：500 mg微晶尿酸鈉加4.5 mL生理鹽水，再加0.5 mL吐溫80，加熱攪拌，配成5 mL尿酸鈉溶液；（2）氧嗪酸鉀溶液：0.3 g氧嗪酸鉀晶體溶解于9.7 mL生理鹽水中配成3%氧嗪酸鉀溶液。

1.3.2動物分組與造模健康成年SD雄性大鼠40只，喂養1周后按隨機數字表法分為4組：正常對照組（A組），痛風組（B組），濕熱組（C組），痛風加濕熱模型組（D組），每組10只。A組：在正常溫濕度（溫度24～28℃，相對濕度60%～75%）環境下，普通飼料喂養，自由飲水15 d；B組：在正常溫濕度環境下，普通飼料喂養，自由飲水15 d。第13天上午，用1 mL一次性無菌注射器配5號針頭，在大鼠右側踝關節背側，從45°方向插入至脛骨肌腱內側，將50 μL尿酸鈉溶液注入到踝關節腔內，制備急性痛風模型［3］；C組：在正常溫濕度環境下，普通飼料喂養，加用200 g/L蜂蜜水自由飲用，且隔日上午按1 g/100 g體質量比率灌服油脂，并隔日灌服52度白酒1 mL/100 g，兩者隔日交替，共持續10 d，然后放入人工氣候箱中［溫度為（32±2）℃，相對濕度（92± 3）%］，每天造模時間為上午8～12時、下午13～17時，共5 d；D組：造模與C組一致，第13天上午，用與B組一致的方法，制備急性痛風模型。

1.4觀測指標

1.4.1一般狀態以造模第1、5、10、15天4個時相點重點觀察各組大鼠的食量、水量、大小便、體質量、外觀、精神狀態等的變化情況，做詳細記錄并進行對比分析。

1.4.2尿液水通道蛋白2（AQP2）測定將每只大鼠放入單獨的大鼠代謝籠中，禁食，自由飲水，收集24 h的尿液3.8～15 mL/只。采用Bradford法測定大鼠尿液中的AQP2含量。

1.4.3血漿內皮素（ET）和降鈣素基因相關肽（CGRP）的測定大鼠腹腔注射麻醉后，腹主靜脈取血2 mL，注入含7.5%EDTA二鈉30 μL和抑肽酶40 μL的試管中，將樣品置于-20℃，采用放射免疫法測定ET和CGRP濃度。

1.4.4大鼠舌的采集及檢測試驗期間肉眼觀察大鼠舌象。試驗結束后處死大鼠，舌根部剪下舌，10%中性甲醛溶液固定。常規脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察舌組織變化。

1.4.5血尿酸（UA）、熱休克蛋白70（HSP70）的測定大鼠麻醉后，腹主靜脈取血4 mL，分別注入2 支EDTA抗凝管中，每支2 mL，搖勻，冷藏。用酶學比色法檢測大鼠血UA，ELISA法定量測定HSP70表達。

1.4.6大鼠踝關節觀察指標及評價方法觀察指標包括周徑［2］、腫脹情況［2］、步態和鏡下踝關節滑膜組織形態學檢查：（1）周徑測量通過皮尺測量實驗前0 h和造模后2、4、6、12、24、48、72 h大鼠右后踝關節同一部位的周徑。（2）炎癥指數分級標準：正常為0級，計0分；關節皮膚紅斑，輕度腫脹，骨性標志可見為1級，計2分；關節明顯紅腫，骨性標志消失，但腫脹局限于關節部位為2級，計4分；關節以外肢體腫脹為3級，計6分。（3）各組大鼠痛風造模72 h后的步態計分步態分級評分標準據文獻改良［4-5］：0級：正常行走，計0分；1級：輕微跛行，受試下肢略有彎曲，計2分；2級：跛行，受試下肢剛觸及地面，計4分；3級：重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走，計6分。（4）鏡下關節滑膜組織形態學檢查。大鼠處死后，以踝關節為中心上下0.5 cm處剪斷，取下受試關節和周圍軟組織，分別快速切取踝關節滑膜，放入40 g/L中性甲醛溶液中固定，乙二胺四乙酸100 g/L脫鈣，常規脫水、透明、包埋、切片和HE染色，顯微鏡下觀察局部病理組織學變化。

1.5統計學分析

2　結果

2.1各組大鼠的一般狀態

2.1.1一般表現A組：在喂養期間，正常飲食飲水、毛色光澤、活動正常，大便正常。B組：造模前表現同A組。自第13天造模后大鼠飲食飲水減少，表現明顯煩躁不安，右踝關節明顯增粗，且紅、腫、熱，伴功能障礙，活動受限等。C組：開始造模后逐漸出現，飲食、飲水量減少，出現倦怠，嗜臥懶動，行動呆滯，毛發蓬松顏色枯槁，小便黃；造模第5天，均開始出現大便溏瀉或黏膩；第11天，出現明顯呼吸粗重，煩躁不安，毛發疏松粗糙，陰囊松弛下垂，大便溏瀉或黏膩癥狀加重，漸見肛周污穢。D組：造模后癥狀與C組相同，且在第13 d開始合并出現B組造模后的相同癥狀。

2.1.2各組大鼠不同時間點體質量變化第10、15天，C、D兩組大鼠體質量與A、B兩組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；A組與B組，C組與D組各時相點比較差異無統計學意義。見表1。

表1　各組大鼠4個不同時相點體質量變化比較（±s，n=10，g）

表1　各組大鼠4個不同時相點體質量變化比較（±s，n=10，g）

注：與A組比較★P＜0.05，與B組比較△P＜0.05。

組別A組B組C組D組第1天243.1±11.7 243.5±12.0 244.3±11.6 241.6±11.4 第5天273.2±15.5 272.8±12.6 268.1±18.7 267.9±12.6 第10天316.6±18.6 309.1±15.4 273.1±19.4★△282.5±14.2★△第15天338.5±24.7 329.3±16.1 266.8±12.1★△269.7±14.1★△

2.2各組大鼠尿液AQP2、血漿ET、CGRP、HSP70結果

（1）4組大鼠尿液AQP2含量比較，A、B組高于C組和D組（P＜0.05）。（2）4組大鼠血漿ET含量比較，A組低于B、C、D組（P＜0.05），B組低于C、D組（P＜0.05），C組低于D組（P＜0.05）。（3）4組大鼠血漿CGRP含量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組高于B、C、D組（P＜0.05），B組低于C組和D組（P＜0.05），C組低于D組（P＜0.05）。（4）4組大鼠血清HSP70含量比較，B、D組高于A、C組（P＜0.05）。血漿ET與CGRP的相關性：A組、B組，ET和CGRP水平呈正相關（r=0.886、r=0.989，P ＜0.05）；C組、D組，ET與CGRP水平呈負相關（r=-0.706、r=-0.725，P＜0.05）。見表2。

表2　各組大鼠ET、CGRP、AQP2、HSP70含量比較（±s，n=10）

表2　各組大鼠ET、CGRP、AQP2、HSP70含量比較（±s，n=10）

注：與A組比較★P＜0.05，與B組比較▲P＜0.05，與C組比較#P＜0.05。

組別A組B組C組D組ET（pg/mL）4.24±0.09 17.65±0.52★19.11±0.14★▲19.96±0.50★▲#CGRP（pg/mL）92.29±0.41 47.89±0.66★55.32±2.16★▲#60.20±0.40★▲#AQP2（mg/mL）0.255±0.017 0.249±0.021 0.234±0.013★▲0.233±0.011★▲HSP70（mg/L）16.44±1.13 34.17±1.32★#15.37±1.46 35.21±1.25★#

2.3大鼠舌象觀察結果

肉眼觀察：A組舌淡紅，苔薄白；B組舌紅，苔微黃；C組舌紅，苔膩微黃；D組舌紅，苔黃膩。鏡下組織病理觀察：A組：絲狀乳頭排列正常，無破壞，乳頭呈圓錐形，尖端略向咽部傾斜。B組：絲狀乳頭復層扁平上皮多有角化、脫落，且乳頭高度參差不齊，尖端變鈍或消失，上皮的厚度較C組變厚。菌狀乳頭固有層毛細血管增多，乳頭數目及其分枝減少。C組：絲狀乳頭復層扁平上皮角化較B組嚴重，上皮的形狀變的矮短，尖端變鈍或消失。菌狀乳頭固有層毛細血管增多，乳頭數目及其分枝增多。D組：絲狀乳頭復層扁平上皮見角化、脫落，根部間或有空洞表現，上皮的形狀矮短并多有破壞，尖端變鈍間或有消失。菌狀乳頭固有層毛細血管增多。見圖1（封三彩圖）。

2.4各組大鼠血UA、踝關節炎癥指數、步態計分結果

4組大鼠血UA比較，差異均無統計學意義（F= 0.530，P=0.665）。各組大鼠踝關節炎癥指數與痛風造模72 h后步態計分比較結果：B組、D組分別與A組、C組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），A組與C組，B組與D組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3　痛風造模72 h后各組大鼠血UA、踝關節炎癥指數、步態計分比較（±s，n=10）

表3　痛風造模72 h后各組大鼠血UA、踝關節炎癥指數、步態計分比較（±s，n=10）

注：與A組比較▲P＜0.05，與C組比較△P＜0.05，下表同。

組別A組B組C組D組血UA（μmol/L）198.12±46.70 195.88±41.08 226.50±79.11 215.75±52.85踝關節炎癥指數—4.91±0.58▲△—4.72±1.17▲△步態計分（分）—4.25±1.28▲△—4.10±1.05▲△

2.5大鼠踝關節周徑

造模后，B組、D組大鼠關節腫脹度均明顯增加，在6～72 h達到高峰，分別與A組、C組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B組與D組，A組與C組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4　不同時間各組大鼠踝關節周徑變化（±s，n=10，cm）

表4　不同時間各組大鼠踝關節周徑變化（±s，n=10，cm）

組別A組B組C組D組0 h 2.72±0.07 2.73±0.07 2.69±0.06 2.71±0.12 2 h 2.72±0.11 2.89±0.06 2.68±0.10 2.88±0.08 4 h 2.74±0.10 3.04±0.11 2.71±0.09 3.03±0.06 6 h 2.73±0.09 3.20±0.22▲△2.72±0.08 3.19±0.07▲△12 h 2.75±0.09 3.26±0.23▲△2.70±0.08 3.28±0.15▲△24 h 2.76±0.08 3.37±0.30▲△2.73±0.07 3.36±0.23▲△48 h 2.74±0.07 3.28±0.28▲△2.74±0.06 3.26±0.30▲△72 h 2.73±0.07 3.23±0.28▲△2.71±0.06 3.25±0.31▲△

2.6各組大鼠鏡下踝關節滑膜組織的形態學結果

A組：踝關節及其周圍組織結構正常清晰，滑膜完整正常，無任何組織病理學改變；B組：局部解剖關節取材時，踝關節腔內可見尿酸鹽結晶沉著。光鏡下可見滑膜壁增厚，血管充血明顯，滑膜及附近軟骨被炎細胞嚴重侵潤破壞，出現組織壞死現象；C組：表現同A組；D組：表現同B組。見圖2（封三彩圖）。

3　討論

中醫認為痛風性關節炎屬于“痹證”、“歷節”等范疇，近年國內學者對痛風證型的研究結果顯示：在我國，尤其是中南部地區，濕熱蘊結證為痛風臨床主要證型［6］。在中醫臨床診斷中，濕熱蘊結證有納呆，渴不多飲，小便黃，大便溏，身體困重，舌質紅，苔滑膩等表現。本實驗研究結果中可以看出，C組與D組在一般狀態中的表現和舌象均符合濕熱蘊結證的表現；在體質量統計中，C、D組均較A、B組體質量下降，與濕熱證表現相一致；B、D組一般狀態表現出局部關節炎癥狀，在大鼠踝關節炎癥指數、步態、踝關節周徑觀測中，與A、C組比較具有統計學意義，均符合局部關節炎癥狀表現；同時B、D組在踝關節滑膜及周圍組織鏡下觀察的形態學結果與痛風性關節炎病理改變相符。

AQP2是近年來發現的存在于腎臟集合管的調節水重吸收的關鍵蛋白之一［7］。研究表明［8］，尿液AQP2含量可作為判斷濕熱證“濕”邪偏重與否的重要指標。本研究中C、D組尿液AQP2含量低于A、B組，且比較差異有統計學意義，可提示此實驗成功復制出痛風性關節炎濕熱證中的“濕”證。ET具有收縮血管作用，CGRP則是舒張血管作用，兩者具有生物學拮抗作用［9］。ET和CGRP協同調節血管收縮與舒張，影響血流量及熱量散發［10-11］，ET含量升高、CGRP含量下降使血管收縮大于舒張，熱量散發受抑制，與濕熱證“熱”的機制相關。本研究中C、D組ET含量高于A組，CGRP含量低于A組，且ET含量和CGRP含量呈負相關，可提示本實驗成功建立出濕熱證中的“熱”證。熱休克蛋白70（HSP70）在人體內是一種具有重要功能的蛋白質。通常僅在細胞內微量表達，但在機體組織遭受損傷、感染、炎癥、細胞因子作用下時，均可引起HSP70過量表達，以維持細胞的正常功能［12］。在本實驗結果中可以佐證關節炎癥的產生和關節滑膜、軟骨損傷壞死的表現。

本實驗造模方法應會對被試動物大鼠的血尿酸有一定的影響，但在四組之間的比較沒有統計學意義，未能通過影響全身嘌呤代謝而使體內血尿酸升高誘導出痛風模型，本模型僅為局部造成急性痛風性關節炎的模型，與人類痛風性關節炎相比還是存在一定的差異，因此后期研究中應對此方面著重進行探索。綜上所述，在持續高脂高糖飲食+濕熱環境+關節腔注射藥物等復合因素干預作用下，可以復制出痛風性關節炎濕熱蘊結證病癥結合的大鼠動物模型。但根據近期研究報道［13］，只有人類和靈長類、鳥類動物尿酸氧化酶（UOX）基因中存在無意突變而沉默，無法合成UOX或合成的UOX不具生物活性，而其他種類動物，包括本實驗選用的大鼠都有完整的UOX基因，嘌呤代謝途徑雖與人類不同，其最終代謝產物為CO2和H2O，本實驗模型的陽性結果可能與造模干預后到指標測試的時間緊密有關。動物模型與血尿酸、UOX及其基因表達的相關性有待進一步研究。

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（本文編輯匡靜之）

Study of the Establishment of the Gouty Arthritis Rat Models with Damp-heat Syndrome

YIN Ming1，XIANG Lili1，XIONG Hui2*，QU Liangye3，QI Xinyu1，ZHOU Biao1
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；2.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410005，China；3.Zhangzhongjing Traditional Chinese Hospital，Nanyang，Henan 473000，China）

R589.7

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.02.003.006.05

2014-12-14

湖南省自然科學基金項目（13JJ3102）；湖南省教育廳科學研究項目（12C0274）；湖南中醫藥大學青年教師科研基金資助。

尹明，男，講師，研究方向：骨與關節疾病的防治。

*熊輝，男，教授，博士研究生導師，E-mail：xh＿hn@sina.com。