艾灸對脾虛胃潰瘍模型大鼠血清TFF及胃黏膜ERK1/2、PCNA的影響

李鐵浪，粟艷梅，祁芳，倪偉，張泓*，張雨辰，郭華（.湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南長沙4008；.婁底市中心醫院康復科，湖南婁底47000；.湖南省中醫院疼痛理療科，湖南長沙40005）

艾灸對脾虛胃潰瘍模型大鼠血清TFF及胃黏膜ERK1/2、PCNA的影響

李鐵浪1，粟艷梅2，祁芳1，倪偉1，張泓1*，張雨辰3，郭華1
（1.湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南長沙410208；2.婁底市中心醫院康復科，湖南婁底417000；3.湖南省中醫院疼痛理療科，湖南長沙410005）

目的觀察艾灸對脾虛胃潰瘍模型大鼠血清三葉因子（TFF1、TFF2）、胃黏膜細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）和增殖細胞抗原（PCNA）的影響，探討艾灸促進胃黏膜增殖修復的可能機制。方法將50只健康SD大鼠隨機抽取10只為空白組，其余40只采用苦寒瀉下法+無水乙醇灌胃建立脾虛胃潰瘍大鼠模型，模型成立后隨機分為模型組、四君子湯組、艾灸組和艾灸非穴位組，每組10只。各組予以相應處理，8 d后采用酶聯免疫吸附法檢測血清中TFF1、TFF2的含量，免疫印跡法檢測胃黏膜組織p-ERK1/2蛋白的表達，免疫組化法測胃黏膜細胞PCNA的表達。結果艾灸足三里、中脘等穴能明顯提高胃黏膜損傷大鼠血清TFF1、TFF2的含量，增強胃黏膜損傷大鼠胃黏膜組織p-ERK1/2蛋白和PCNA的表達（P＜0.05或P＜0.01）。結論艾灸能促進脾虛胃潰瘍大鼠損傷胃黏膜的增殖修復，其可能的機制是通過提高TFF1、TFF2的含量，激活TFF/ERK信號轉導通路，增強PCNA的表達有關。

艾灸；胃黏膜增殖修復；三葉因子；細胞外信號調節激酶1/2；增殖細胞抗原

〔Abstract〕ObjectiveToobservetheeffectsofmoxibustiononcontentsofserumtrefoilfactor（TFF1，TFF2），andgastricmucosaextracellularsignal-regulatedkinase1/2（ERK1/2）andproliferatingcellnuclearantigen（PCNA）in spleendeficiencygastriculcerratmodels.Toexplorethepossiblemechanismofmoxibustioninpromotingmucosal proliferation repair.Methods 10 rats were randomly selected from the 50 healthy SD rats，the other 40 rats were built into the spleen deficiency gastric ulcer models by the cold diarrhea down+anhydrous ethanol gavage methods.After modeling，the ratswererandomlydividedintothemodelgroup，Sijunzidecoctiongroup，moxibustiongroupandnonacupoint-moxibustion group，10 in each group.The serum contents of TFF1 and TFF2 were detected by ELISA，the expression of gastric mucosa p-ERK1/2 protein was measured with Western blot，and the expression of gastric mucosa PCNA was determined by immunohistochemical method.Results Moxibustion Zusanli and Zhongwan points can significantly improve contents of TFF1 and TFF2 in rats with injury gastric mucosa，increase the expression of gastric mucosa p-ERK1/2 protein and PCNA in rats with injury gastric mucosal（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Moxibustion can promote the proliferation and repair of injury gastric mucosal in spleen deficiency gastric ulcer rats.The mechanism may be related with increasing the contents of TFF1 and TFF2，activating TFF/ERK signal transduction pathway，and enhancing the expression of PCNA.

〔Keywords〕moxibustio；mucosalproliferationrepair；trefoilfactor；extracellularsignal-regulatedkinase1/2；cell proliferation antigen

胃黏膜損傷后增殖修復是由多因素介導，并相互影響而形成的一個復雜的網絡體系。三葉因子家族（trefoil factor，TFF）是一群主要由胃腸道黏液細胞分泌的對胃黏膜修復與重建有重要作用的小分子多肽［1］，已有文獻證實，在大鼠胃潰瘍的愈合過程中，ERK1/2活性顯著增強，而阻斷這一通路胃潰瘍的愈合過程明顯延緩［2］。增殖細胞核抗原（PCNA）合成水平反映了細胞增殖率及DNA合成率，是反映細胞增殖狀態的直接量度指標［3］。大量臨床報道證實艾灸對脾虛胃潰瘍有很好的療效［4-5］，其機制可能是通過提高TFF1、TFF2、ERK1/2、PCNA的表達，促進胃黏膜損傷后的增值修復，以起到對胃潰瘍的治療作用［6-7］。本實驗通過對TFF/ERK信號轉導途徑中的TFF、ERK1/2以及他們之間相關性的研究，以期部分探討艾灸對脾虛胃潰瘍大鼠胃黏膜細胞增殖的調節機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

健康Sprague-Dawleyy大鼠50只，體質量200～250 g，雌雄各半，SPF級，飼養溫度20～25℃，濕度50%～70%，湖南中醫藥大學動物實驗中心提供（動物質量合格證編號：4304701041）。大鼠適應性飼養1周后用于本實驗。

1.2主要試劑和儀器

1.2.1主要試劑及藥品SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、TFF1、TFF2酶免試劑盒、兔抗大鼠ERK1/2抗體、兔抗大鼠PCNA多克隆抗體均由長沙市岳麓區維泰實驗用玻璃儀器經營部提供。四君子湯：由人參、白術、茯苓、炙甘草（由湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供）組成，按照9∶9∶9∶6比例配制，配成含生藥0.233 g/mL的四君子湯藥液；太極灸：直徑7 mm，高1 cm（河南南陽市臥龍漢醫艾絨廠）。

1.2.2主要儀器820型薄片切片機（美國型AO公司）；TGL16M臺式高速冷凍離心機（長沙科威實業有限公司）；QL-901旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；DYY-6C電泳儀、DYCZ-24EN電泳槽、DYCz-4OA轉膜儀（北京六一）；a85-1x磁力攪拌器（金壇榮華儀器有限公司）。

1.3動物分組及造模

50只大鼠隨機抽取10只為空白組。其余40只大鼠用200%的大黃濃縮液4℃灌胃，1 mL/100 g體質量，每天2次，連續14 d，建立脾虛模型。大黃灌胃第14天，大鼠禁食24 h后，用灌胃針將無水乙醇注入大鼠胃腔內，注入劑量為0.6 mL/100 g體質量，建立胃潰瘍模型。模型成立后，再按隨機數字表法分為模型組、艾灸穴位組（下稱艾灸組）、艾灸非穴位組（下稱非穴組）和四君子湯組，每組10只。1.4施治方法

1.4.1穴位定位動物穴位定位法及擬人對照法定位參照林文注主編《實驗針灸學》［8］，以胸鎖聯合和恥骨聯合連線下1/4與上3/4交點為肚臍。足三里：膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處；中脘：臍與胸骨劍突連線中點，約臍上20 mm處；脾俞：第十二胸椎下，旁開5 mm；胃俞：第十三胸椎下，旁開5 mm。足三里非穴對照點：膝關節后內側，在脛骨內側髁約5 mm處；中脘非穴對照點：中脘旁開1 cm；脾俞、胃俞非穴對照點：與脾俞、胃俞平行后正中線旁開1 cm。

1.4.2實驗步驟除空白組外，大鼠造模結束后給予大黃濃縮液致虛，同時各組給予相應的處理：所有大鼠捆縛于鼠板，空白組、模型組、四君子湯大鼠不予施灸；艾灸組、非穴組分別大鼠捆縛固定于鼠板上施灸，將艾柱黏于穴位或對照點施灸，選穴如下：（1）艾灸組：①足三里（雙）、中脘；②脾俞（雙）、胃俞（雙）。（2）非穴組：①足三里對照點（雙）、中脘對照點；②脾俞對照點（雙）、胃俞對照點（雙）。兩組每天取1組穴位施灸5壯（約30 min，①、②交替進行），連續8 d。四君子湯組每天每只予以四君子湯8 mL/kg灌胃，其余組則分別灌服同等換算體表面積的生理鹽水，每天2次，連續8 d。

1.5取材及檢測方法

實驗治療結束后，用20%烏拉坦以10 mL/kg腹腔注射麻醉，剖腹后，將胃的幽門部和賁門部用止血鉗結扎，快速用一次性負壓采血針從腹主動脈采血5 mL置于37℃恒溫水浴箱30 min，4℃低溫離心，3 000 r/min，離心15 min，離心后取上清液置于-20℃冰箱保存，釆用酶聯免疫吸附法（ELISA）測血清TFF1、TFF2的含量。在兩結扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗，取胃組織損傷明顯處一小塊（5 mm×10 mm），然后放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定24 h后，用免疫組化法測胃組織中PCNA的表達。另取一小塊（10 mm×10 mm）入液氮冷凍存于-80°冰箱保存，用Western Blot法檢測胃組織中磷酸化ERK1/2的蛋白表達。其中TFF1、TFF2、p-ERK1/2由長沙高新開發區原點生物技術部檢測，PCNA由湖南中醫藥大學基礎組胚實驗室檢測，詳細步驟均按試劑盒說明書嚴格操作。

1.6統計學分析

所有數據使用SPSS 16.0軟件進行處理。所有測量數據用“x±s”表示，資料進行正態性檢驗：符合正態分布者，多組計量資料采用單因素方差分析，方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法；不符合正態分布者采用多組資料的秩和檢驗（H檢驗）。

2　結果

2.1艾灸對脾虛胃潰瘍大鼠TFF1、TFF2的影響

與空白組相比，其他各組大鼠血清TFF1、TFF2明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，四君子湯組、非穴組、艾灸組大鼠血清TFF1、TFF2明顯提高（P＜0.01）；與非穴組相比，艾灸組、四君子湯組大鼠血清TFF1、TFF2明顯升高（P＜0.01）；艾灸組與四君子湯組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1　各組大鼠TFF1和TFF2的比較（±s，n=10）

表1　各組大鼠TFF1和TFF2的比較（±s，n=10）

注：與空白組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與艾灸非穴組比較☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。下表同。

組別空白組模型組四君子湯組非穴組艾灸組TFF1（ng/mL）3.52±0.19 4.20±0.24△△7.67±0.20△△▲▲☆☆4.74±0.14△△▲▲7.80±0.22△△▲▲☆☆TFF2（pg/mL）52.89±2.14 67.27±2.71△△129.50±3.03△△▲▲☆☆78.94±2.97△△▲▲131.10±4.37△△▲▲☆☆

2.2艾灸對脾虛胃潰瘍大鼠ERK1/2及PCNA的影響

與空白組相比，其他各組大鼠胃黏膜ERK1/2 及PCNA含量提高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，四君子湯組、非穴組、艾灸組大鼠胃黏膜ERK1/2 及PCNA含量升高（P＜0.05或P＜0.01）；而與非穴組相比，艾灸組、四君子湯組大鼠胃黏膜ERK1/2及PCNA含量明顯提高（P＜0.05或P＜0.01）；艾灸組與四君子湯組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2及圖1～2（圖2見封三彩圖）。

表2　各組大鼠ERK1/2及PCNA的比較（±s，n=10）

表2　各組大鼠ERK1/2及PCNA的比較（±s，n=10）

組別空白組模型組四君子湯組非穴組艾灸組ERK1/2 0.383±0.073 0.444±0.063△0.656±0.111△△▲▲☆☆0.539±0.079△△▲▲0.698±0.121△△▲▲☆☆PCNA（平均光密度）0.160±0.041 0.222±0.037△0.355±0.064△△▲▲☆0.283±0.091△△▲0.365±0.083△△▲▲☆☆

圖1　各組大鼠p-ERK1/2蛋白磷酸化水平凝膠電泳圖

3　討論

TFF1主要在胃體及胃竇黏膜上皮表面細胞分泌表達；研究發現TFF1與細胞遷移、增殖、分化、血管形成等密切相關［9］。TFF2主要在胃體、胃竇和十二指腸下段特異性表達，張紹榮等［10］利用PCR技術發現hTFF2能促進實驗性大鼠胃潰瘍黏膜上皮細胞增殖和潰瘍底部血管生成。ERK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家庭的重要成員之一，有ERK1和ERK2兩種亞型，磷酸化的ERK是ERK的活性形式，能激活轉錄因子，促進基因的表達，參與細胞生長、發育、分裂及細胞間的功能同步等多種生理過程，對于細胞周期的運行和基因表達具有重要的調控作用［11］。劉曉玲等［12］研究發現補中益氣湯通過上調TFF1、EGFR的表達來激活MEK/ERK信號傳導途徑，從而促進細胞遷移、增殖或分化。國外新近研究發現，TFF2能通過EGFR/MAPK信號傳導通路來刺激膽管癌細胞的增殖［13］。增殖細胞核抗原（PCNA）是一種細胞周期調節蛋白，PCNA的出現與細胞增殖周期密切相關，G1期PCNA逐漸增多，S期達高峰，它能準確地反映細胞的生長速度和狀態［14］。胃黏膜PCNA的表達能較準確的反映胃黏膜損傷和修復過程中胃黏膜細胞的增殖活性。在國外有學者揭示了TFF與PCNA之間的緊密的聯系，Amaguchi H等［15］研究發現，大鼠胃黏膜損傷后胃黏膜肌層的TFF2陽性細胞會伴有細胞核增殖抗原（PCNA）陽性。這與本次實驗結果一致：大鼠胃黏膜損傷后，其胃黏膜PCNA上升，且上升趨勢與TFF1、TFF2及ERK1/2一致，說明大鼠胃黏膜損傷后有一定的自行愈合修復功能，并啟動了細胞增殖活動。

研究發現四君子湯對胃潰瘍模型大鼠有顯著的防治作用，其能加強胃黏膜損傷大鼠后的黏膜增值修復已從表皮生長因子（EGF）、胞外信號調節激酶（ERK）等途徑被證實［16-17］。本研究發現四君子湯與艾灸均能明顯上調TFF1、TFF2、ERK1/2及PCNA的表達水平，提示艾灸、四君子湯對胃黏膜損傷大鼠后胃黏膜增殖修復有較好的調控：啟動黏膜修復機制，增強ERK1/2蛋白磷酸化，從而使胃黏膜PCNA的含量上升，進而到達加強黏膜損傷后增殖修復的效應。且艾灸穴位的綜合效應優于艾灸非穴對照點，表明足三里、中脘等穴具有一定的腧穴特異性。而艾灸穴位的綜合效應與四君子湯雖無明顯差異，但艾灸組TFF1、TFF2、ERK1/2及PCNA表達的趨勢均略高于四君子湯組。臨床中艾灸能避免四君子湯煎煮的繁瑣，方便易行，且艾灸的溫熱效應能給病人帶來舒適感，故值得臨床大力推廣。

［1］Thim L.A new family of growth factor-like peptides.“trefoil”disulphide loop structures as a common feature in breast cancer associated peptide（ps2），pancreatic spasmolytic polypeptide （PSP），and frog skinpeptides（spasmolysins）［J］.FERSLett，1989，25（1）：85-90.

［2］Pai R，Ohta M，Itani RM，et al.Induction of mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway during gastric ulcer healing in rats［J］.Gastroenterology，1998，114（4）：706-713.

［3］Sehmassmann A，Peskar BM，Stetfler C，et al.Efects of inhibition of purstaglandin endoperoxide synthase-2 in chronic gastro-intestinal ulcer models in rats［J］.Br J Pharmacol，1998，123（5）：795-804.

［4］朱重炫，周丹，王富春.針灸治療胃潰瘍臨床研究進展［J］.吉林中醫藥，2011，31（11）：1 134-1 138.

［5］彭芬，易受鄉，常小榮，等.從脾虛證與物質代謝的關系探討艾灸溫補脾胃的作用［J］.中華中醫藥學刊，2011，29（6）：1 237-1 240.

［6］劉密，常小榮，嚴潔，等.艾灸對胃黏膜損傷大鼠胃粘膜表皮生長因子、轉化生長因子-α及其受體的影響［J］.針刺研究，2011，36（6）：403-408.

［7］劉密.艾灸促進應激性胃私膜損傷大鼠胃私膜修復作用及其ERK信號轉導途徑的研究［D］.湖南中醫藥大學博士論文，2012.

［8］林文注.實驗針灸學［M］.上海：上海科學技術出版社，1994：118.

［9］TomasettoC，RioMC.PleiotropiceffectsofTrefoilFactor 1 deficiency［J］.Cell Mol Life Sci，2005（62）：2 916-2 920.

［10］張紹榮.基因重組人三葉因子2對實驗性大鼠胃潰瘍的療效及其作用機制［J］.中國醫學創新，2009，6（34）：1-3.

［11］王冰，吳燕紅，楊志，等.MAPK/ERK信號轉導通路的分子生物學特征及生物效應［J］.第四軍醫大學學報，2005，26（S）：18-21.

［12］劉曉玲，王汝俊，付銓盛.補中益氣湯對脾虛大鼠胃粘膜MEK/ ERKmRNA表達的影響［J］.中藥藥理與臨床，2013，29（1）：5-8.

［13］Kanuengnuch K，Menheniott TR，Giraud AS，et al.Trefoil factors：Tumor progression markers and mitogens via EGFR/MAPK activationincholangiocarcinoma［J］.WorldJGastroenterol，2011，17（12）：1 631-1 641.

［14］Amaguchi H，Goldenring JR，Kaminishi M，et al.Association of spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia with carcinogen administration and oxyntic atrophy in rats［J］.Lab Invest，2002，82（8）：1 045-1 052.

［15］洪金標，彭宏，易受鄉，等.艾灸對機體產生的多重效應及其機理探討［J］.中華中醫藥學刊，2010，28（2）：277-282.

［16］王海燕，朱躍科，陳緩.四君子湯防治大鼠應激性胃潰瘍的初步研究［J］.世界華人消化雜志，2005，13（13）：1 595-1 596.

［17］杜鵑，王秀芹，季鳳清，等.加味四君子湯對脾虛胃潰瘍大鼠細胞外信號調節激酶信號傳遞分子的影響［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2007，16（1）：6-11.

（本文編輯匡靜之）

Effect of Moxibustion on Serum TFF and Gastric Mucosa ERK1/2 and PCNA in Gastric Ulcer Model Rats with Spleen Deficiency Symptom

LI Tielang1，SU Yanmei2，QI Fang1，NI Wei1，ZHANG Hong1*，ZHANG Yuchen3，GUO Hua1
（1.College of Acumox and Tuina，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.Department of Rehabilitation，Loudi Central Hospital，Loudi，Hunan 417000，China；3.Department of Pain and Physiotherapy，Hunan Hospital of TCM，Changsha，Hunan 410005）

R245.81

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.02.017.049.04

2014-11-25

國家自然科學基金項目（81173327）；湖南省自然科學基金項目（13JJ6060）；湖南省教育廳創新平臺項目（11K047）。

李鐵浪，男，副教授，碩士研究生導師，研究方向：針灸治病機制的研究。

*張泓，男，教授，博士研究生導師，E-mail：zh5381271@sina.com。