葛屬11份種質基于核rDNA ITS序列的親緣關系分析

蔣向輝　劉良科　佘朝文

摘要：在對葛屬11份種質核rDNA ITS序列克隆測序的基礎上，用MEGA 6.0軟件對11份種質及其近緣種進行聚類分析。結果表明，葛屬11份種質的ITS序列在長度和G+C含量上相差較大，長度變化在669～765 bp之間，最大相差96 bp，G+C含量在52.98%～59.89%，最大相差6.91%；藤縣粉葛（Tengxian Pueraria thomsonii）、常德粉葛（Changde Pueraria thomsonii）、武隆苦葛（Wulong Pueraria peduncularis）這3個種的ITS序列特點相近，G+C含量都在53.74%左右，長度小于700 bp，在發育樹上聚為1類，種質親緣關系很近；合川粉葛（Hechuan Pueraria thomsonii）和蒙自粉葛（Mengzi Pueraria thomsonii） ITS序列相似性較高，G+C含量與序列長度都相差不大，在發育樹上聚為1類；通道山葛（Tongdao Pueraria montana）聚為1類，與其他物種存在較遠的距離；德興宋氏超級粉葛（Dexing Soong Super Pueraria thomsonii）與常寧野葛（Changning Pueraria lobata）ITS序列和G+C含量一樣，在發育樹上聚為1類，但與會同山葛（Huitong Shange）、大衛粉葛（Dawei Pueraria thomsonii）處于不同的分支上，親緣關系相對較遠。

關鍵詞：葛屬；ITS序列；親緣關系；聚類分析

中圖分類號： S567.902.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0046-04

葛（Pueraria lobata）別稱葛藤、葛麻葉，系豆科碟形花亞科（Phaseolease）葛屬植物，最先產于中國和日本的琉球地區[1]，中國最早關于葛的記載是在《詩經》和《神農本草經》上。世界上葛有20個種，我國有12個種，其中常被作為藥用的有8個種，我國除新疆維吾爾自治區、西藏壯族自治區和青海回族自治區3個省份外，其他省份都有葛分布的相關報道，產量高和資源比較豐富的種類有野葛與粉葛[2]。葛莖是我國南方一些省（區）的一種常食蔬菜，葛根含異黃酮成分葛根素、葛根素木糖苷、大豆黃酮、大豆黃酮苷及β-谷甾醇、花生酸，又含多量淀粉，有解表退熱、生津止渴、止瀉的功能，能改善高血壓、糖尿病病人的項強、頭暈、頭痛等癥狀[3]。葛根毒性低、藥源廣、價格低，因此，加強對葛根的新藥和保健品開發具有良好的前景。

根據2010版《藥典》規定，野葛和粉葛都可以作為葛的正品使用，但它們是同科不同屬的2種植物，有效成分含量差異較大，在開發利用中對其來源的均一性難以保證，因此，采用合適的標記對葛種質資源進行親緣關系分析具有重要的意義。葛屬不同種之間形態差異較小，根據形態學來判定葛屬種質資源之間的親緣關系存在較多的爭議，目前，國內在分子水平上鑒定葛屬種質之間親緣關系的研究報道尚少。本研究基于ITS序列對葛屬11份種質進行聚類分析，在分子水平上進一步鑒定葛屬11份種質的親緣關系，為葛屬不同來源的種質區分與鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為葛屬不同來源的11種種質（表1）。

1.2 試驗方法

采用改良的CTAB法提取葛屬11份種質基因組DNA。用于擴增的ITS序列引物參照White等設計的ITS通用引物[4]，上游引物為ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。擴增程序：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物回收采用長沙安比奧生物試劑有限公司生產的DNA回收試劑盒，將回收產物與pMD 18-T質粒相連，重組質粒轉化進入大腸桿菌（E. coil）DH5α（菌株來自湖南大學生物學院）；獲得重組菌斑，采用長沙安比奧生物試劑有限公司生產的質粒提取試劑盒提取重組質粒，在雙酶切鑒定后送上海生物工程有限公司進行測序，測得序列經比對確認，將序列在GENEBANK上登錄，獲得登錄號。根據獲得的序列，以NCB網站已有的甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]ITS序列為外類群，利用MEGA 6.0軟件，分別采用MP法、NJ法和UPGMA法3種方法對11份種質及其近緣種進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 ITS序列分析

一般情況下，每個物種DNA中G+C的含量是特定的，能夠反映屬種之間的親緣關系，DNA中G+C含量越高，其變異也越小；親緣關系越近，不同物種之間DNA中G+C含量的差別越小[5]。由表2可見，11份種質ITS序列G+C含量有很大的差異，G+C含量在52.98%～59.89%之間，最大相差6.91百分點，其中大衛粉葛G+C含量相對最高，ITS1序列中G+C含量為54.08%～64.05%，ITS2序列中G+C含量為5169%～64.19%，ITS1序列G+C含量比ITS2序列變化稍大；序列長度波動范圍也較大，大小在669～765 bp，相差 96 bp，其中，通道山葛的ITS序列相對最長；德興宋氏超級粉葛和常寧野葛G+C含量和序列長度相同，G+C含量為5458%，序列長度為731 bp；常德粉葛和蒙自粉葛G+C含量和序列長度相似。從序列長度來看，ITS1序列的變異范圍在242～331 bp之間，ITS2序列的變異范圍在178～279 bp，5.8S序列相對保守，序列長度在169 bp左右。

2.2 系統發育分析

由表3可見，葛屬11份種質和外類群植物甘薯的遺傳距離為0.002～0.792，藤縣粉葛與武隆苦葛、德興宋氏超級粉葛與常寧野葛、藤縣山葛與會同山葛的遺傳距離均最小，為0.002，相互間的親緣關系最為接近；其次是常德粉葛與武隆苦葛，遺傳距離為0.004；遺傳距離最大的是蒙自粉葛與番薯，達到0.792，這兩者的親緣關系相對最遠。