橡膠樹SSR—SRAP—AFLP標記遺傳圖譜構建

王惠君　王文泉　和麗崗　賀軍軍

摘要：利用橡膠樹GT1與IAN873雜交組合183株實生苗的F1代群體作為構圖群體，利用SSR、SRAP、AFLP等3種分子標記對該群體進行遺傳連鎖分析，構建1張包括18個連鎖群、372個標記位點的橡膠樹分子遺傳連鎖圖（LOD≥3），其中包括19個SSR標記、73個SRAP標記、280個AFLP標記，連鎖圖譜的總圖距覆蓋1 735.9 cM，所有標記間的平均圖距為5.22 cM。在此連鎖圖譜上的標記區間為[8，46]，所有連鎖群長度區間為[55.3 cM，134.7 cM]。LG9連鎖群包含標記最少為8個；LG1連鎖群包含標記最多為46個；LG1的平均圖距最小為2.80 cM；LG17的平均圖距最大為7.92 cM。總圖譜中存在圖距大于20 cM的空隙為5個。

關鍵詞：橡膠樹；分子標記；遺傳連鎖圖譜

中圖分類號：S794.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0041-05

收稿日期：2015-01-04

基金項目：國家自然科學基金 （編號：31261140363、31000537、31171230）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（編號：ITBBZX0843）；國家重點基礎研究發展計劃（編號：2010CB126601）。

作者簡介：王惠君（1981—），男，山西原平人，碩士，助理研究員，從事生物多樣性研究。E-mail：382494058@qq.com。

通信作者：王文泉，博士，研究員，博士生導師，從事熱帶生物資源、熱帶經濟作物結構基因組學與分子育種及熱帶珍稀瀕危野生植物的保護生物學研究。E-mail：wquanw@hainan.net。

橡膠樹（Heva brasiliensis）屬大戟科橡膠樹屬植物[1]，原產于南美洲亞馬遜河流域。具有高彈性及耐高溫等特性的天然橡膠是合成橡膠不可替代的材料，也是重要的戰略物資、工業原料。雖然分子標記技術在橡膠樹研究方面已取得了一定進展，但關于橡膠樹分子生物學研究還很欠缺。Lespinasse等以橡膠樹雜交組合（PB260×RO38 106） F1代群體為材料，構建了第1張總圖距為2 144 cM及標記間平均圖距為3 cM的橡膠樹遺傳圖譜，包含18個連鎖群，由301個RFLP標記、388個AFLP標記、18個SSR標記、10個同工酶標記組成[2]。和麗崗利用雜交組合（IAN873×GT1）的195個 F1代群體構建了總圖距為1 455.57 cM及標記間平均距離為 558 cM 的AFLP連鎖遺傳圖，包含18個連鎖群，由261個AFLP標記組成[3]。馮素萍等以雜交組合（IAN873×熱研88-13）的94個F1代群體構建了總圖距為1 937.06 cM及標記間平均距離21.29 cM的連鎖群，包含18個連鎖群，由91個SSR標記組成[4]。王惠君利用雜交組合（IAN873×GT1）的F1代群體構建了總圖距為774 cM及標記間平均距離為11.38cM的連鎖遺傳圖，該圖包括18個連鎖群，由7個SSR標記、61個SRAP標記組成[5]。Triwitayakorn等用EST-SSR分子標記構建了總圖距為842.9 cM且包含23個連鎖群的橡膠樹連鎖遺傳圖[6]。以上遺傳圖譜為進一步分析橡膠樹重要性狀的QTL定位及分子標記輔助選擇育種奠定了基礎。本試驗應用SSR、SRAP、AFLP等3種分子標記技術對橡膠樹雜交組合（IAN873×GT1）的195株實生苗的F1代群體構建高密度的橡膠遺傳連鎖圖譜，旨在為開發利用橡膠樹資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 作圖群體的構建

GT1：天然橡膠生產國主要栽培品種的魏克漢種質，具有抗寒、中產、抗旱特點。IAN873：抗南美葉疫病無性系品種的非魏克漢種質，抗寒但不抗風，生長量、產量比GT1高。以云南省熱帶作物研究所提供的利用非近交親本橡膠樹雜交組合（IAN873×GT1）得到的183個F1代群體作為構圖群體。

1.2 基因組DNA的提取

以橡膠樹嫩葉片作為材料，選用改良CTAB法[7]提取橡膠樹基因組DNA。改良提取緩沖液的組成為：Tris/HCl（pH值8.0）100 mmol/L，EDTA（pH值8.0）60 mmol/L，NaCl 1.4 mol/L，CTAB 2%。用瓊脂糖凝膠1.5%電泳分析檢測提取的DNA；用紫外分光光度計法檢測其濃度、純度。

1.3 SSR分析

參照網站公布的信息進行SSR引物的合成。SSR擴增反應參照馮素萍等的方法[4]，采用25 μL體系并且在ABI-PCR儀上進行PCR擴增反應，擴增反應程序為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 變性1 min，60 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 SRAP分析

設計SRAP引物序列[8]，所用引物由上海生物工程技術有限公司提供，其中F-primer合成32條，R-primer 合成21條。依據薛丹丹等報道[9]，設定的原初20 μL反應體系優化后為DNA模板50 ng、10×PCR buffer （Mg2+） 2.0 μL、dNTPs（20 mmol/L） 0.4 μL、F-primer（50 ng/μL）0.6 μL、R-primer（50 ng/μL）0.6μL、Taq（5 U/μL）0.4 μL、ddH2O 15.0 μL。參照Li等的PCR擴增反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，5個循環；隨后將退火溫度升至51 ℃，34個循環；72 ℃延伸9 min，4 ℃下保存。使用瓊脂糖凝膠1.0%電泳對此PCR擴增反應產物進行檢測。

1.5 AFLP分析

參照王惠君等的方法[10]，限制性內切酶采用經典的EcoRⅠ、MseⅠ組合。酶切程序和DNA片段與接頭的連接同時進行。每個DNA樣品酶切連接反應，反應體系20 μL：DNA 500 ng，T4連接酶緩沖液2 μL，ATP 1.25 μL，MseⅠ、EcoRⅠ接頭分別1 μL，EcoRⅠ和MseⅠ0.3 μL，T4連接酶 0.6 μL；設定的反應程序為37 ℃ 380 min、16 ℃ 380 min。酶切鏈接的產物稀釋后才可以使用，選擇濃度稀釋到原液的 1/3 進行預擴增反應。預擴增體系20 μL：取酶切連接稀釋后DNA 產物 5 μL，緩沖液 2 μL，MSeⅠ引物 （M00） 和EcoRⅠ引物（E00）各0.6 μL（其中Primer E00：5′-GACTGCGTACCAATT CA-3′、Primer M00：5′-GATGAGTCCTGAG TAAC-3′）dNTPs 0.4 μL，Taq酶0.12 μL。參數設置為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 80 s，31個循環；最后72 ℃ 5 min。預擴增引物后再增加2個堿基作為選擇性擴增引物，進入選擇性擴增階段，用8對EcoRⅠ、MseⅠ引物進行組合，即64個引物組合。參數設置為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 40 s（-1 ℃/循環），72 ℃ 80 s，12個循環（梯度PCR）；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，22個循環；最后72 ℃ 5 min。擴增反應均在BIOMITRA-T1熱循環儀上進行。

1.6 數據轉換及作圖軟件應用

記錄的分離譜帶是由作圖的F1群體親本譜帶所決定的，SRAP標記、大多數的AFLP標記屬于顯性標記，母本、父本有的譜帶記錄為1，無譜帶記錄為0；SSR標記和少數的AFLP標記屬于共顯性標記，記錄譜帶時只要與父本譜帶一致的記錄為A，與母本譜帶一致的記錄為B，如果是雜合的記錄為H；此外不管顯性標記還是共顯性標記，只要譜帶缺失或者模糊的均記為“-”；估計多態性譜帶的分子量大小是依據與標準分子量 DL2 000 標準帶型的相對位置。對于一些引物，假如1對引物同時可以檢測到幾個位點，依據擴增出分子量大小排序，按從大到小的原則標記。在其所用引物后加“-1、-2、-3”和“-a、-b、-c”符號進行區別標記。作圖之前，按照JoinMap3.0要求的數據格式將A、B、H或者0、1轉換成原始矩陣所要求的數據格式a、c；不同水平偏分離的標記在其后面用“*”表示；輸入所需數據后，用LOD groupings進行計算并獲得連鎖群，輸出遺傳連鎖圖譜[11-12]。

2 結果與分析

2.1 篩選引物及多態性標記

利用SSR、SRAP、AFLP等3種分子標記技術對橡膠樹進行遺傳圖譜構建。選擇來自NCBI的30對SSR引物分別進行多態性篩選，對2個親本進行篩選，其中有13對引物多態性豐富且譜帶穩定。從13對引物中擴增出37條帶，其中35條為多態性帶，多態性比率高達94.59%。在顯著水平（5%）上共發現18個標記表現為偏分離，比率達51.43%。對96對引物組合雙親進行SRAP篩選分析，從中篩選出20個擴增比較好且存在明顯多態性引物的組合，共獲得166條帶，經過分析，其中有113條為多態性譜帶，多態性比率為68.07%，SRAP多態性、重復性較好。在顯著水平（5%）上發現共有51個標記表現為偏分離，頻率達45.13%。用64對AFLP組合引物雙親本進行篩選分析，從中篩選出具有明顯多態性的標記13對。總共獲得675個多態性位點，對這些遺傳位點的標記分離比進行統計分析，剔除不用于作圖的異常分離標165個，在顯著水平（5%）上發現198個標記表現為偏分離。其中符合作圖要求的以3 ∶1分離模式比例的標記共有162個，符合1 ∶1分離模式比例的標記共有150個（表1）。

2.2 分子標記分離分析及遺傳圖譜的構建

利用JoinMap3.0對823個多態性標記進行遺傳連鎖分析作圖，在LOD≥3條件下獲得包含372個標記（其中SSR標記19個，SRAP標記73個，AFLP標記280個）、18個連鎖群的橡膠樹遺傳圖譜（圖1），連鎖群數目與橡膠樹18對染色體數目相一致。其中SSR、SRAP及AFLP標記的比例分別為5.1%、19.3%、75.3%。獲得最終的遺傳連鎖圖譜覆蓋總長度為1 735.9 cM，標記間的平均圖距為 5.22 cM。連鎖群上的標記數區間范圍為[4，46]，連鎖群的長度區間范圍為[55.3 cM，134.7cM]，群內平均圖距區間[127 cM ，17.02 cM]（表2）。用于連鎖分析的823個標記當中，首先剔除掉異常分離標165個AFLP標記，其中286個標記未構建入連鎖群，占34.75%，286個標記中包括230個AFLP標記、40個SRAP標記、16個SSR標記。構建的18個連鎖群中，LG9包含標記數最少，為8個；LG1包含的標記數最多，達46個。整個遺傳連鎖圖譜最小圖距為0.5 cM，在LG1上，最大圖距為25.2 cM，在LG11上；平均圖距最小為 280 cM，分布在LG1上；平均圖距最大為7.92 cM，分布在LG17上；遺傳圖譜包含5個空隙（≥20 cM），LG11上2個，LG15、LG17、LG18各1個。

2.3 偏分離分析

構建的橡膠樹遺傳連鎖圖上包含372個標記位點，其中5%水平上包含47個標記位點不能滿足孟德爾分離比，其偏分離水平表現顯著的標記占總標記的12.63%；在1%水平上包含119個標記位點不能滿足孟德爾分離比，其偏分離水平表現極顯著的標記占總標記的 32.00%。連鎖群上偏分離標記占總標記的44.62%。從偏分離位點的分布來看，每個連鎖群上均有分布。其中 LG1上偏分離標記個數最多為23個，占LG1總標記數的50.00%；LG11、LG16上的偏分離標記個數最少，都為1個，分別占LG11、LG16的8.33%、11.11%，同時LG16上的偏分離標記在所有連鎖群中所占比例也是最少的；LG9上的偏分離標記在所有連鎖群中所占比例最多，為7500%；其中 LG7、LG10上的偏分離標記分布與其他連鎖群相比較聚集。其他大部分偏分離位點在連鎖群上分布比較均勻。

3 結論與討論

3.1 SSR、SRAP及AFLP作圖分析

本研究主要利用SSR、SRAP及AFLP等3種分子標記進行遺傳連鎖圖譜的構建，結果顯示，AFLP標記在遺傳圖譜作圖中所占比例最多，雖然此種標記的信息量非常豐富，但是試驗程序要求精度高并相對繁瑣，同時聚集現象頻繁導致在所繪制連鎖群上出現較多大的空隙。SSR 標記雖然揭示的多態性較豐富、可信度、重復率較高，但開發引物費用較高，因此開發的SSR標記不多。SRAP分子標記試驗操作容易、結果穩定、擴增條帶清晰，較容易進行數據分析，并且過程簡單，重復

性好。開發的SRAP引物中包含CCGG、AATT的核心序列，保證擴增反應是針對基因組的開放閱讀框區域。此種特殊性增強了擴增反應結果與表型的相關性，同時可以更多地揭示所選材料表型差異性。因此，適用于較高密度遺傳圖譜的構建。

3.2 作圖群體及圖譜構建分析

橡膠樹為大戟科橡膠樹屬植物，屬于高度雜合的高大喬木，異花授粉，世代周期較長，基因組龐大，遺傳背景相關材料較少，因而很難得到像其他農作物一樣的重組近交系作為遺傳作圖，這給橡膠樹遺傳圖譜構建帶來一定困難。大部分林木具有無性繁殖特性，這個特點對保存作圖群體較為有利，作圖群體建立后就可以永久性保存，同時還可以反復測定性狀。以大多數林木的重要經濟性狀作為數量性狀，憑借這一特性進行QTL（數量性狀位點）定位分析較為容易，從而可以建立或選擇1個較為理想的分離群體作為構建遺傳圖譜的首要條件。目前林木遺傳作圖群體較為常用的方法主要有半同胞作圖群體、全同胞交配群體、單倍體作圖群體（針葉樹）、F1作圖群體、F2群體、回交1代（BC1）群體、回2代群體（BC2）。依據雙假測交理論[12-14]，即一方親本的大部分雜合位點在另一方親本呈顯純隱性或為雜合位點時，這些位點在F1代群體中發生分離。親本材料遺傳差異越大，多態性也就越高，越有利于豐富圖譜信息量。因此，本研究以橡膠樹質量性狀相差較大的IAN873×GT1的F1代183株實生苗群體作為構建橡膠樹遺傳圖譜材料。

在分子生物學領域，大多數學者認為，作為1個染色體連鎖框架圖最低要求為所用標記間的平均距離不能大于 20 cM。用于進行主效基因定位作為試驗目的構建的連鎖框架圖譜的平均距離范圍一般區間為[10 cM，20 cM]，遇到特殊情況時平均距離要求更小。如以基因克隆作為試驗目的的最低要求為所克隆基因的目標區域標記間的平均圖距區間為[0 cM，1 cM]。如用于QTL定位分析作為試驗目的的最低要求為平均距離范圍區間為[0 cM，10 cM]。本試驗所構建的橡膠樹遺傳連鎖框架圖譜除了有5個大于20 cM的空隙外，該圖的圖距和平均圖距區間范圍分別為[0.5 cM，19.6 cM]和[2.80 cM，7.92 cM]，符合農藝性狀QTL分析和主效基因定位的最低要求。因此，本試驗可作為橡膠樹農藝性狀QTL分析的基礎。

3.3 偏分離分析

生物學界普遍認為，分離現象也是生物進化的推動因素之一[13]，導致偏分離的原因很多。目前主要原因有：遺傳搭車效應[14-15]，即在母本體內存在使雄配子體失活的相關基因，此類基因位點轉錄出來的酶或RNA等影響配子體的存活力、競爭力，從而調控配子體選擇。染色體丟失，即當物種雜交時染色體片段可能發生丟失，在同一連鎖群上所用的標記發生偏離[16]。花粉選擇的結果，即在合子形成前柱頭與花粉之間的相互作用抑制了部分基因漂流，當合子形成后會引起敗育，很有可能是由于結構上存在差異或同源染色體遺傳，或者是自交引起的不親和性導致的主要隔離機制[17-21]。數據統計時因各種原因如試驗環境、操作程序、試劑、儀器等也會引起誤差，導致譜帶清晰度差異，不同個體間譜帶缺失、譜帶辨認模糊以及操作人員的誤判等也可能會導致偏分離。本試驗中，1%水平上偏分離的標記率為 32.00%，5%水平上比率為 12.63%，未表現出有較為明顯偏向親本某一方趨勢的。偏分離標記個數分布最多的在 LG1上為23個，偏分離標記所占比例大于0.6在LG9、LG10、LG 18上，說明在以上連鎖群當中分布影響偏分離的遺傳因子區域可能較為廣泛存在。

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