飼糧能量差異對海南豬IGFBP6基因mRNA表達的影響

孫瑞萍　晁哲　鄭心力　王峰　黃麗麗　劉圈偉　魏立民

摘要：將36頭質量為（61.70±1.00） kg的海南豬隨機分為2個處理組，分別飼喂高、低能量水平的2種日糧，以研究不同能量水平對IGFBP6基因表達量及生產性能的影響。相比之下，高能量水平飼糧可顯著提高海南豬平均日增質量（P<0.05），并顯著降低料肉比（P<0.05）。RT-PCR結果表明，低能量水平飼糧可促進IGFBP6基因表達量。海南豬IGFBP6基因表達量與平均日增質量、平均日采食量均呈不顯著正相關（P>0.05）；與料肉比呈顯著負相關（P<0.05）。飼糧能量水平可影響海南豬的生產性能，但對海南豬IGFBP6基因表達量的影響不顯著。

關鍵詞：海南豬；能量水平；IGFBP6基因；基因表達

中圖分類號： S828.5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0035-03

豬生長性狀是復雜的數量性狀，而營養是除遺傳因素外影響生長的另一個重要因素，它雖然無法改變動物的遺傳性狀，但可通過營養學途徑，調控豬生長等數量性狀基因的表達，從而在表型上改善胴體品質和肉質。IGFBPs在GH/IGFs生長軸的調節中起著重要作用，這些結合蛋白的作用受營養、生理條件、其他激素等諸多因素的影響。IGFBP6基因作為IGFs超家族中的一員，在成年動物體內廣泛表達，因其與 IGF-2 結合的特異性而受到研究者們關注。近幾年研究表明，IGF2基因在胎兒生長發育、肌肉生長等方面具有重要調控作用，與豬的生長速度、背膘厚等產肉性狀相關[1-4]，是影響動物生長發育的主要候選基因。在IGF依賴型作用途徑中，IGFBP6通過與IGF-2的結合對動物的生長發育調節產生重要影響。海南豬是我國地方豬的一個品系，適應性和抗逆性極強，具有肉質細嫩、胴體瘦肉率高、肌纖維特細、肌間脂肪多等優點。迄今，關于IGFBP6對動物生長發育影響的研究尚較少，且主要集中于不同品種豬IGFBP6基因mRNA在不同組織間表達量的研究[5-7]，而關于不同能量水平對豬 IGFBP6 基因mRNA表達量的影響，以及IGFBP6基因mRNA表達量與生產性能相關性的研究尚未見報道。本研究利用RT-PCR技術并結合生長性狀，探討不同能量水平對海南豬IGFBP6基因表達量的影響，以及IGFBP6基因表達量與生長的相關性，以期從分子水平解釋營養對生長產生影響的機理。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

采用單因子試驗設計，將36頭質量為（61.70±1.00） kg的海南豬隨機分為2個處理組，分別飼喂高、低能量水平的日糧，每個處理組設3個重復，每個重復6頭豬。高能量水平日糧參照NRC（1998）《豬營養需要》配制，確定消化能（DE）為14.21 MJ/kg；低能量水平日糧參照NY/T 65—2004《豬飼養標準》配制，確定DE為12.95 MJ/kg，蛋白質含量均為1300%（表1）。

1.2 飼養管理

按照海南省農業科學院畜牧獸醫研究所豬場飼養管理辦法進行飼養管理，在7 d預飼期后，對2個處理組分別飼喂高、低營養水平的飼料。試驗期用濕拌料，每日喂2次，自由飲水，保持圈舍清潔并定期消毒，正式試驗期為40 d。

1.3 測定指標

1.3.1 生長性能指標 分別于試驗開始、結束時空腹稱質量，以圈為單位計算日采食量、日增質量、料肉比。

1.3.2 樣本采集 試驗結束時，選取12頭質量接近于平均質量的海南豬進行屠宰取樣（每重復選2頭，每處理組選6頭），肉樣采集位置為個體的最后肋骨、最后腰椎間的單側背最長肌，采集后立即置于液氮中速凍并于-70 ℃保存，用于提取肌肉組織總RNA。

1.3.3 IGFBP6基因實時定量表達量的測定 取最后肋背最長肌樣本約30 mg，加入液氮并研磨成粉，轉入1.5 mL Eppendorf管中，采用RNA Simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA，按說明書進行操作。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取總RNA的完整性，并通過D260 nm/D280 nm檢測樣本純度。采用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（天根公司產品）對總RNA進行反轉錄（reverse transcription，RT），配制反應體系、設置反應條件、合成cDNA均按說明書進行操作，反轉錄產物于-20 ℃保存備用。

采用Primer primer 5.0軟件設計引物，由上海生工有限公司進行合成（表2）。

使用實時熒光定量PCR儀，反應體系為20μL：模板

1.4 統計與分析

采用2-ΔΔCT計算方法分析目的基因的相對表達量。采用SPSS 13.0統計軟件對海南豬組織IGFBP6基因相對表達量進行t檢驗及相關性分析，試驗結果用平均數±標準差（x±s）表示。采用LSD法進行平均數之間的多重比較。

2 結果與分析

2.1 日糧能量水平對海南豬生長性能的影響

由表3可知，日糧能量水平對海南豬平均日增質量、料肉比的影響均達顯著水平（P<0.05），而對末質量、平均采食量的影響則不顯著（P>0.05）。初始質量差異不顯著的海南豬經40 d的飼養，其試驗期末質量雖未達顯著水平，但各能量水平組的平均日增質量均達到顯著水平。可見，提高生長后期日糧的能量水平，可顯著提高海南豬的平均日增質量，降低料肉比。

2.2 能量水平對IGFBP6基因表達量的影響

由圖1可知，在低能量水平條件下，IGFBP6基因表達量為1.09，高能量水平條件下為0.82，兩者差異不顯著（P>0.05）。

2.3 IGFBP6基因表達量與生長性能的相關性分析

由表4可知，IGFBP6基因表達量與料肉比呈顯著負相關（P<0.05），與平均日增質量、平均日采食量均呈不顯著正相關（P>0.05）。

3 結論與討論

能量是動物生長發育、繁殖所必需的營養物質之一，能量過量或缺乏均可引起豬生長速度的變化或質量的增減。馬書林在研究不同能量水平對奶牛生產性能、繁殖性能的影響時指出，將哺乳奶牛日糧的能量水平提高10%～20%，對其產奶量的影響雖與對照組差異不顯著（P>0.05），但添加能量可減緩奶牛質量的下降[8]。賈金鳳研究發現，適當提高豬育肥期日糧的能量水平，可提升豬的日增質量和經濟效益[9]。劉秋研究發現，不同能量水平對豪豬全期平均日采食量、日增質量、料肉比的影響均達顯著水平（P<0.05）[10]。本試驗結果表明，提高日糧能量水平對海南豬試驗末質量、采食量的影響雖不顯著，但可顯著提高海南豬的平均日增質量，并降低料肉比（P<0.05），這與劉秋在豪豬上的研究結果相一致。

營養物質可通過各種途徑對基因表達進行多層次、多水平的調控，從而影響動物機體的生長發育和物質代謝。關于能量水平對IGFBP6基因表達量的影響尚未見報道。Towle等研究發現，日糧中的主要營養物質可顯著影響動物體內許多基因的表達，其中包括一些控制機體代謝關鍵酶的基因，從而影響機體的代謝過程[11-12]。Marinaro等研究發現，由IGFBP6基因引起的細胞間相互作用似乎受碳水化合物的抑制[13]。Osgerby等在對馬的研究中發現，不同營養水平會影響胎兒的大小，并隨IGFBPs的濃度而改變，營養水平越低則母體的IGFBP6基因mRNA越低（妊娠45～90 d），隨后開始上升，可見IGFBP6基因的水平受營養水平的影響，且其表達量具有時空效應[14]。本研究中營養水平對IGFBP6基因表達量有一定的影響，即低能量水平的飼糧可使IGFBP6基因表達量升高，但與高能量組差異不顯著?？赡艿脑驗楦摺⒌蜖I養水平之間差別不大，尚未達到顯著調控IGFBP6基因表達量的程度；雖然能量水平可影響IGFBP6基因的表達，但未必是調控IGFBP6基因表達量的最佳途徑。

Mei所構建的IGFBP6基因敲除小鼠在生長、繁殖性狀上與野生小鼠沒有顯著差異[15]。Bienvenu等研究發現，高表達人源IGFBP6基因的轉基因小鼠質量減輕，雌性小鼠生育能力顯著下降；過表達IGFBP6基因的轉基因小鼠十二指腸質量顯著減輕，其他器官與對照組無顯著差異[16]。上述研究并不能完全證明IGFBP6基因對小鼠生長和繁殖的作用，IGFBPs家族蛋白代謝過程中的一系列代償作用也可能導致敲除小鼠與野生小鼠在表型上無顯著差異。萬斯妮對豬IGFBP6基因第4外顯子Taal-RFLP（T-C）位點的多態性進行檢測，發現該基因第4外顯子突變位點與豬胸腰椎膘厚、肌肉失水率、促甲狀腺素的含量均顯著相關（P<0.05）[5]。王文君采用PCR-SSCP技術在IGFBP6、G3079A、T4069G處檢測到2個SNP，相關性分析表明，AT單體型豬的生長發育性狀、產肉性狀均高于GG單體型豬，而板油質量的指標卻恰恰相反，可見 IGFBP6 基因是豬生長發育性狀的一個候選基因[6]。

IGFBP6基因是IGFs超家族中的一員，其細胞層面的研究表明，IGFBP6基因通過與IGF2結合阻斷其與細胞表面受體的結合，從而可抑制由IGF2所介導的生長、發育、細胞粘連等[17]。Zhao等指出IGFBP6基因在胚胎時期的肌肉組織中表達量較高，可能與肌肉的分化有關[18]。虞德兵研究發現IGFIⅡ在豬肌肉組織中的表達水平隨日齡的增加呈下降趨勢[19]。房希碧等研究發現，豬肌肉組織中IGFBP6基因的表達量隨月齡的增加呈上升趨勢，可見肌肉組織中的IGFBP6基因可能通過依賴IGF的途徑發揮對生長發育的調節作用，但此調節作用并非影響豬體型大小的關鍵因素[7]。上述研究進一步揭示了IGFBP6基因對動物生長、繁殖的作用，以及IGFBP6基因表達量對動物生長發育性狀的影響。

本試驗首次研究了IGFBP6基因相對表達量與肥育豬生產性能的關系，結果表明IGFBP6基因表達量與料肉比呈顯著負相關（P<0.05），與平均日增質量、平均日采食量均呈不顯著正相關（P>0.05）。

參考文獻：

[1]Tilley R E，McNeil C J，Ashworth C J，et al. Altered muscle development and expression of the insulin-like growth factor system in growth retarded fetal pigs[J]. Domestic Animal Endocrinology，2007，32（3）：167-177.

[2]唐中林，李 勇，鄧 宏，等. IGF2熒光定量PCR方法建立及其在中外豬胚胎骨骼肌中的表達[J]. 農業生物技術學報，2008，16（2）：202-207.

[3]郭玉姣，唐國慶，李學偉，等. 豬脂肪組織中IGF2和IGFBP3基因表達的發育性變化及其品種差異[J]. 遺傳，2008，30（5）：602-606.

[4]Stinckens A，Vanden M K，Luyten T，et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy[J]. Animal Genetics，2007，38（1）：67-71.

[5]萬斯妮. 豬IGFBP6和CYR61基因片段的克隆、定位、多態及組織表達譜研究[D]. 武漢：華中農業大學，2006：40-45.

[6]王文君. 豬胰島素樣生長因子結合蛋白1-6基因核苷酸變異的研究[D]. 北京：中國農業大學，2006：113-116.

[7]房希碧，賈泓瑤，張 昕，等. 西藏小型豬與軍牧一號白豬IGFBP-6基因表達差異分析[J]. 吉林農業大學學報，2013，35（6）：727-731.

[8]馬書林. 初產母牛圍產期不同能量水平日糧對其生產性能和繁殖性能的影響[D]. 北京：中國農業科學院，2012.

[9]賈金鳳. 不同能量水平對冬季生長豬生產性能和經濟效益的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2014，8（15）：104-105.

[10]劉 秋. 不同水平消化能和蛋白質對6～8月齡豪豬生產性能的影響[D]. 長沙：湖南農業大學，2012.

[11]Towle H C，Kaytor E N，Owle H C，et al. Regulation of the expression of lipogenic enzymegenesby carbohydrate[J]. Annual Review of Nutrition，1997，17（1）：405-433.

[12]Clarke S D，Abraham S. Gene expression：nutrient control of pre-andpost-transcriptional events[J]. FASEB Journal，1992，6（13）：3146-3152.

[13]Marinaro J A，Neumann G M，Russo V C，et al. O-glycosylation of insulin-like growth factor（IGF）binding protein-6 maintains high IGF-Ⅱ binding affinity by decreasing binding to glycosaminoglycans and susceptibility to proteolysis[J]. European Journal of Biochemistry，2000，267（17）：5378-5386.

[14]Osgerby J C，Wathes D C，Howard D，et al. The effect of maternal undernutrition on the placental growth trajectory and the uterine insulin-like growth factor axis in the pregnant ewe[J]. Journal of Endocrinology，2004，182（1）：89-103.

[15]Mei Q. The actions of IGFBPs on growth and glucose metabolism in transgenic mouse models[D]. New Brunswick：New Jersey，2010.

[16]Bienvenu G，Seurin D，Grellier P，et al. Insulin-like growth factor binding protein-6 transgenic mice：postnatal growth，brain development，and reproduction abnormalities[J]. Endocrinology，2004，145（5）：2412-2420.

[17]Murphy L J. Insulin-like growth factor-binding proteins：functionaldiversity or redundancy？[J]. Journal of Molecular Endocrinology，1998，21（2）：97-107.

[18]Zhao X，Mo D L，Li A N，et al. Comparative analyses by sequencing of transcriptomes during skeletal muscle development between pig breeds differing in muscle growth rate and fatness[J]. PLoS One，2011，6（5）：e19774.

[19]虞德兵. 豬IGF-Ⅱ基因變異對豬生長性狀及肌肉發育相關基因表達的影響[D]. 南京：南京農業大學，2007.