Trizol法提取普通小球藻總基因組DNA

段文斌　金剛　代建國　張麗君　欒崇林　于化泓

摘要：Trizol法主要應用于動植物RNA提取，由于其在提取RNA的過程中將DNA有效分離到有機相中，并且在有機相中DNA未被降解，因此本研究采用Trizol法提取具有細胞壁的普通小球藻的基因組DNA，發現提取得到的DNA純度和產率高，且DNA完整性好。經檢測：D260 nm/D280 nm=1.86，平均得率為977 μg/g鮮質量；瓊脂糖電泳檢測其條帶清晰，未發生降解。該方法具有簡單快速獲得高純度和高產率的小球藻基因組DNA的優點。

關鍵詞：Trizol法；普通小球藻；DNA提取

中圖分類號：S917 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0033-02

Trizol法最早由Chomczynski等提出，用于提取細胞或組織中的總RNA[1]。經過Trizol處理過的樣品，其總RNA、DNA及蛋白質分別分布在上層水相、中間層、下層有機相。Trizol試劑中含有的苯酚、異硫氰酸胍等物質，將細胞迅速破碎，并抑制釋放出來的核酸酶，同時能夠保持RNA、DNA的完整性，因此對RAN、DNA的同時提取純化十分有用[2]，大大節約試驗時間，提高試驗效率。小球藻（Chlorella vulgaris）作為一種單細胞綠藻，具有極強的光合自養能力；含有豐富的脂質、蛋白質、維生素、核酸、食物纖維、葉綠素等，都是人體健康不可或缺的營養物。小球藻還生產多種生物活性物質[3]。由于其脂類可以達到細胞干質量的10%～30%而被用于生產生物柴油[4-5]；通過轉基因小球藻可以被用來生產病毒抗體[6]；也發現小球藻具有抗菌活性[7]；小球藻可以治理重金屬、有機物以及氮磷污染[8]。因此，科研工作者開始對小球藻進行深入研究。本研究嘗試使用Trizol法[9]提取小球藻基因組DNA，以期獲得簡單快速獲取高純度高產率基因組DNA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

普通小球藻購自中國科學院典型培養物種保藏委員會海洋生物種質庫，使用SE培養基培養，在三角瓶中培養，培養溫度為25 ℃，光照強度條件為2 000 lx，光暗周期設置為12 h/12 h；培養至對數后期取樣，試驗前將普通小球藻4 ℃黑暗處理24 h，將細胞內儲存的淀粉消耗掉，將有利于DNA的提取。

1.2 試劑

Trizol Reagent 購自Invitrogen公司，氯仿、無水乙醇及異丙醇均為國產分析純，10 mol/L NH4Ac，TE（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值8.0），70%乙醇。

1.3 儀器

離心機：德國Eppendorf公司生產；凝膠成像系統：美國SYNGENE公司生產；核酸/蛋白分析儀；BECKMAN COULTER DU800；酶標儀：Thermo Fisher SCIENTIFIC。

1.4 試驗步驟

將培養至對數期（D680 nm約為0.6[10]）的普通小球藻 300 mL 在1 500 g下離心5 min進行收集并稱鮮質量（500～600 mg），用新鮮培養基重懸浮1次，并再次離心收集；加入 5 mL Trizol試劑，吹打混勻，轉入玻璃勻漿器研磨10 min；加入1.5 ml氯仿，混合均勻，在10 000 g、室溫下離心10 min，棄上層水相和中間變性蛋白層，吸取下層有機相至新的離心管中；加入等體積的無水乙醇沉淀DNA，-20 ℃靜置10 min，10 000 g、室溫下離心10 min；棄去上清，加入100 μL TE溶解管底的DNA沉淀，吹打混勻，加入40 μL 10 mol/L NH4Ac，混勻，4 ℃靜置10 min，10 000 g、室溫下離心10 min；吸取上清至新的離心管中，加入140 μL的異丙醇，混勻，-20 ℃放置10 min，12 000 g、室溫下離心10 min，棄去上清；加入70%的乙醇洗滌2次沉淀，離心，吸去離心管底的液體，在室溫下晾干5 min，加入80 μL TE溶液溶解DNA。

1.5 檢驗方法

使用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析以及核酸/蛋白分析儀測定其D260 nm、D280 nm及其比值；取5 μL溶有DNA的TE溶液稀釋400倍后進行DNA濃度測定，并根據DNA濃度計算公式（DNA濃度=稀釋倍數×D260 nm×50/1000）計算出濃度值，計算結果單位為μg/μL。

2 結果與分析

使用Trizol法提取普通小球藻基因組DNA，其紫外吸收光譜在260 nm、280 nm波長處都有吸收峰，D260 nm/D280 nm值為1.86，表明該方法提取得到的DNA樣品沒有蛋白質等其他雜質，純度較高（表1）；并且具有高DNA產率，平均產率為977 μg/g鮮質量）。從圖1可以看出，瓊脂糖凝膠電泳成像后的圖像中點樣孔處干凈，表明并沒有蛋白質污染；DNA條帶單一，無拖尾及降解現象，說明所提取的DNA完整性好并且沒有RNA污染，電泳圖譜與21 kb位置相齊。

3 討論

由于小球藻具有很厚的細胞壁[11]，并且是單細胞真核藻類，細胞直徑3～8 μm，這些小球藻自身的特性給小球藻基因組DNA提取造成了不小困難，其細胞壁破碎和細胞溶解效果對基因組DNA的提取產率和效果具有較大影響；已有小球藻基因組DNA提取方法[12]，如任學艷等的SDS法[13]。SDS法試驗步驟較多，在研磨時由于沒有缺少合適的保護試劑，DNA容易被降解，影響到基因組DNA的產率和提取速度。CTAB法現在有較多的改進方法[13-14]，但是基因組得率較低，張桂和等提取的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）得率為 695 μg/g鮮質量[14]。陳穎等的超聲波法和纖維素酶法有RNA污染、DNA降解以及產率低的問題。本試驗采用加入Trizol后進行玻漓勻漿器研磨，一是保證小球藻的充分破碎，對小球藻基因組DNA起到保護作用，是保證基因組DNA的得率的重要因素。

本試驗設計出了提取普通小球藻基因組DNA的方法；該方法穩定可靠，并且具有簡單快速獲取高純度和高產率基因組DNA的優點。該方法可以被用于分子生物學試驗作為常規提取普通小球藻基因組DNA的方法。

參考文獻：

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