新型三維復合仿生網絡的構建及其組織相容性評價

崔曼，張欣，馬麗桃，熊艷杰，車鵬程，姚芳蓮，孫紅△

新型三維復合仿生網絡的構建及其組織相容性評價

崔曼1，張欣1，馬麗桃1，熊艷杰1，車鵬程1，姚芳蓮2，孫紅1△

目的構建并評價新型三維復合仿生網絡的組織相容性。方法采用仿生學方法，將殼聚糖、羥基磷灰石、明膠、果膠按一定比例制成新型三維復合仿生網絡，將小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1與材料進行復合培養，通過倒置相差顯微鏡、石蠟切片常規染色、掃描電鏡、F-DA熒光染色法評價細胞相容性；將制備好的生物支架材料植入SD大鼠的背部皮下，術后2、4、8、12周評價組織相容性、血管化能力及體內降解情況。結果新型三維復合仿生網絡呈三維多孔狀，細胞在材料上貼附生長良好，呈多角形或梭形，形態飽滿；皮下包埋實驗發現：早期有輕微的炎癥反應，隨時間延長而消退，后期有血管化發生，材料降解吸收比較緩慢。結論新型三維復合仿生網絡組織相容性好，易于血管化，是一種很好的骨組織工程支架材料。

新生血管化，生理性；組織相容性；組織工程；殼聚糖；三維復合仿生網絡

由創傷、腫瘤、炎癥等造成的大范圍骨缺損如果沒有骨移植材料很難被修復，因此尋找理想的骨移植材料仍是外科的難題之一。目前，已經有很多種天然材料和合成材料用于修復骨缺損以促進骨再生［1］。三維支架可以創造一種微環境，支撐細胞黏附生長、增殖和發揮功能。此外，骨組織工程支架材料還應具有一定的力學強度和接近正常人骨的孔隙率和孔徑［2］。為此，本研究以殼聚糖、明膠、果膠為基材，通過接枝偶聯反應，引入活性基團，經納米羥基磷灰石的原位生成反應，構建了新型三維復合仿生網絡，并利用細胞與材料復合培養法和皮下植入試驗評價該材料的組織相容性，為臨床骨缺損修復選擇合適的骨移植材料提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料SD大鼠，體質量200～250 g，雌雄不限，河北聯合大學動物實驗中心提供，MC3T3-E1細胞（中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心提供），胎牛血清（天津血液研究所），α-MEM培養基（Gibco公司，美國），二甲基亞砜（DMSO，天津灝洋生物工程公司），掃描電鏡（XL30 PHILIPS，荷蘭），倒置相差顯微鏡（Nikon，日本），熒光顯微鏡（Olympus，日本）。常規培養基組分：α-MEM培養基+10%胎牛血清。

1.2方法

1.2.1新型三維復合仿生網絡的制備由天津大學化工學院高分子科學與工程系提供，采用仿生學方法，在殼聚糖加明膠的基礎上，將羥基磷灰石和果膠的復合物分散到殼聚糖明膠溶液中，以戊二醛交聯形成新型三維復合仿生網絡。材料按實驗的要求制備成直徑1 cm，厚0.5 cm，60Co照射消毒備用。

1.2.2新型三維復合仿生網絡與MC3T3-E1細胞的復合培養將MC3T3-E1細胞接種于25 cm2的培養瓶內并加入5 mL常規培養基，置37℃、5%CO2培養箱中靜置培養，每隔48 h換新鮮培養基，倒置相差顯微鏡觀察細胞相互融合達80%～90%時用0.25%胰酶消化，新型三維復合仿生網絡置于24孔培養板內，將MC3T3-E1細胞懸液以2×105/mL密度接種，每孔加1 mL常規培養基，置37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。

1.2.3觀察指標24 h、72 h時倒置相差顯微鏡觀察新型三維復合仿生網絡邊緣的細胞形態、生長狀況及培養基有無混濁。于接種后1 d、7 d、14 d取材，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，二甲苯透明，中性樹膠固封，光學顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。于接種后1 d、7 d、14 d取材，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，表面噴金后，在掃描電鏡下觀察細胞的黏附、生長及形態學特征。利用熒光素二醋酸鹽（F-DA）原位檢測材料內的細胞生長形態。

1.2.4皮下植入實驗取SD大鼠12只，材料植入前60Co照射消毒。術前3 d用8%硫化鈉對手術部位脫毛，手術當天用10%的水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量經腹腔注射麻醉。固定后用75%乙醇消毒手術部位3次，然后鋪無菌孔巾，在脊柱正中切開皮膚，切口長約3 cm，提起腰背筋膜剪開，鈍性分離，將材料左右各埋入1枚，縫合皮膚。術后3 d每天給予青霉素5萬U，單籠飼養。術后2、4、8、12周分別處死3只大鼠，取出實驗材料，剖開組織和材料界面，觀察組織包繞情況及炎癥反應程度。4%多聚甲醛固定標本，常規石蠟包埋切片，行HE染色，光鏡觀察。

2　結果

2.1新型三維復合仿生網絡的大體形態及掃描電鏡下結果大體外觀呈多孔海綿狀。掃描電鏡下可見三維多孔的網狀結構，材料平均孔隙率為90%，空隙之間的連通較好，空隙形態、取向規則有序，測量孔徑大小為100～200 μm，見圖1。

Fig.1　SEM observation on the novel 3-D composite bionic network（×100）圖1　新型三維復合仿生網絡掃描（×100）

2.2倒置相差顯微鏡觀察MC3T3-E1細胞接種于培養瓶后細胞呈圓球形，懸浮狀態，2～3 h細胞開始貼壁，24 h細胞呈長梭形或紡錘形，大部分細胞伸出突起，與鄰近細胞的突起相連，48 h細胞逐漸接觸相連成片狀，3～5 d細胞長成致密的單層，界限不清。MC3T3-E1細胞與材料復合培養，可觀察到周邊細胞貼附生長好，培養基無混濁。

2.3HE染色觀察細胞分別于接種后1、7、14 d，HE染色顯示細胞形態清晰，呈梭形、紡錘狀或多角形，細胞核大，呈圓形或橢圓形，核仁清楚可見。細胞接種后14 d，細胞數量增多，貼附生長良好，呈多角形或梭形，細胞質豐富，可見粉染的細胞外基質，見圖2。

Fig.2　Histology observation on the 14-day-co-culturing tissue（HE，×200）圖2　復合培養14 d組織學觀察（HE×200）

2.4掃描電鏡觀察接種細胞后第1天，可見少量MC3T3-E1細胞呈球形，較為分散；其后細胞增多，呈梭形、星形；細胞進一步增殖，形態飽滿并相互融合，伸出偽足狀細長突起，伸入材料間，形成一種錨狀結構，牢固黏附于材料表面，并具有良好的伸展狀態。隨著培養時間的延長，細胞密度逐漸增加，至14 d通過材料網狀孔隙觀察，在材料附著的細胞分裂增殖，分泌大量的細胞外基質包裹材料，見圖3。

Fig.3　SEM observation on the 14-day-co-culturing tissue（×500）圖3　復合培養14 d掃描電鏡觀察（×500）

2.5熒光染色細胞分別于接種后1、7、14 d進行熒光染色觀察。F-DA熒光染色顯示細胞生長良好，形態清晰，呈長梭形或多角形，部分區域的細胞聚集生長，有形成結節的趨勢；接種后第14天細胞還可在孔內呈多層生長，見圖4。

Fig.4　Fluorescence staining observation on the 14-day-co-culturing tissue（×100）圖4　復合培養14 d F-DA染色熒光電鏡觀察（×100）

2.6組織相容性觀察大體標本觀察：手術后5 d，所有大鼠切口愈合良好，無感染現象。分別在術后2、4、8、12周以過量麻醉藥分次注射，使動物深度麻醉，在背部原切口部位切開皮膚，發現多數材料無移位，在材料周圍1 cm處整塊切下組織，在包埋部位未發現感染、積液及材料碎裂，且材料降解緩慢，至12周仍可見材料。術后2周，材料完整，表面可見細小出血點，易于剝離；術后4周，材料表面可見明顯毛細血管；術后8周，材料與組織粘連緊密，不易剝離，毛細血管較前更多；術后12周，材料與周圍組織界限不清。

HE染色觀察：2周時無組織壞死現象，可見少量散在的中性粒細胞（無明顯聚集）、淋巴細胞、漿細胞等炎癥細胞，未見明顯的吞噬細胞、多核巨細胞，見圖5A；4周時炎性細胞減少，新生的血管和成纖維細胞長入，見圖5B；8周時微孔狀間隙部分充滿成纖維細胞、大量的功能性毛細血管，并可見多核巨細胞及淋巴細胞，見圖5C；12周時材料的微孔狀結構未消失，但間隙出現纖細的膠原纖維，排列較規律，血管較前減少，見圖5D。

3　討論

3.1骨組織工程的基本要素支架、種子細胞與生長因子是骨組織工程學的重要研究內容，尋找理想的細胞外支架材料更是現階段的研究熱點。理想的支架材料必須具備良好的生物相容性和可降解性、一定的機械強度、三維多孔結構和骨傳導性［3-4］。

3.2殼聚糖、明膠、果膠等應用于骨組織工程材料的構建殼聚糖是多糖中僅有的一種堿性氨基多糖，其結構和某些性質與細胞外基質中的主要成分氨基多糖極相似，利于細胞的黏附、生長、增殖，具有明顯堿性、良好的生物相容性和生物降解性［5］，可將其改造成需要的形狀和強度，如凝膠液、凝膠膜、多孔三維支架材料應用于組織工程中［6］。膠原是細胞外基質（ECM）的主要結構蛋白，明膠是其部分變性衍生物，具有良好的生物相容性。其中含有天冬氨酸-甘氨酸細胞結合結構域，利于細胞粘連。殼聚糖-明膠復合物可以模擬ECM作為皮膚和軟骨的替代材料。果膠富含半乳糖醛酸及甲酯化的半乳糖醛酸單位，可結合蛋白質和其他多糖，存在于植物細胞壁中，有剛性且化學性質穩定［7］。果膠是一種聚陰離子多糖，可以攜帶信號分子并傳輸許多生物活性物質，可以作為一種新的生物醫用材料［8］。

3.3納米羥基磷灰石在骨組織工程中的作用天然骨是具有復雜結構的生物復合材料，1/3為有機成分，其中膠原占90%，非膠原成分占10%，2/3為無機成分，主要是磷酸鈣鹽類，基本單位為納米級羥基磷灰石［9］。因此提高材料的機械性能十分重要，為了更好地模擬天然組織中細胞外基質的結構和功能，在殼聚糖-明膠-果膠網絡復合膜的基礎上加入納米羥基磷灰石制成新型三維復合仿生網絡。納米羥基磷灰石是一種性能優良的無機陶瓷材料，同時具有獨殊的特性，例如良好的生物相容性和生物活性，以及柔韌的組織結構，是一種可應用于臨床的很有潛能的組織工程材料［10］。復合支架中納米羥基磷灰石的加入能提高支架的生物相容性［11］，在增強細胞增殖的同時，還促進了材料的骨傳導性和骨誘導性［12］。

3.4組織相容性評價在評價材料的相容性過程中，最直接的方法是體外細胞復合培養法和體內直接接觸法。細胞培養法是檢測材料生物相容性的重要手段之一，具有敏感性高和實驗周期短等優點［13］。本實驗采用MC3T3-E1細胞，細胞行為與成骨細胞相似；材料具有大小合適的孔徑、較高的孔隙率和類似自然骨的連通微孔結構，利于MC3T3-E1細胞的黏附生長、營養物質的滲入和廢物的排出，并促進細胞在材料上的遷移、分化和增殖。通過將MC3T3-E1細胞與材料復合培養，直接觀察細胞的貼附生長、分化和增殖情況，細胞在材料上生長良好，分布均勻，結合牢固，無排斥反應發生，說明新型三維復合仿生網絡的所有組分具有適合細胞生長的微環境，該材料適合種子細胞的停泊、生長、黏附、增殖，可用做組織工程支架。“體內植入試驗”將材料植入大鼠背部皮下，可從宏觀和微觀水平評價材料對組織的局部反應，包括早期的炎癥反應和后期血管化及纖維增生情況。然而，在骨組織再生的一個主要的挑戰是血管化，如果血液供應（營養和氧氣）不能快速建立，該中心的工程化骨將很快出現壞死。由于氧在活組織的毛細血管擴散是有限的，約150 μm［平均毛細血管間距為（304±30）μm］，因此，在較大體積的組織工程構建中，血管化情況至關重要［14］。本研究顯示該材料引起體內的炎癥反應輕微且持續時間很短，4周左右即明顯緩解，在4～8周可見大量新生血管的形成，在12周左右穩定，表現出良好的組織相容性。組織學觀察可以獲得早期、充分的血管化，降解吸收緩慢。因此新型三維復合仿生網絡在短期觀察中具有良好的組織相容性，但該材料植入骨缺損部分是否具有成骨誘導活性和增加骨愈合，是否可以用于骨重建和骨缺損的替代材料，需要進一步研究。

（圖5見插頁）

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（2014-09-09收稿2014-10-20修回）

（本文編輯李鵬）

Construction of novel 3-D composite bionic network and evaluation of its histocompatibility

CUI Man1，ZHANG Xin1，MA Litao1，XiongYanjie1，CHE Pengcheng1，YAO Fanglian2，SUN Hong1△
1 Department of Pathology，Basic Medical Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2 School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University
△Corresponding authorE-mail：xsun1@hotmail.com

ObjectiveTo construct novel 3-D composite bionic network and evaluate the histocompatibility.MethodsThe novel 3-D composite bionic network was prepared from chitosan，hydroxyapatite，gelatin and pectin in certain ratio by biomimtic approach，which was co-cultured with MC3T3-E1.The cell compatibility was studied by using inverted phase contrast microscope，routine paraffin section staining，scanning electron microscopy and F-DA staining.The resultant scaffold material was implanted into the dorsal subcutaneous space of SD rats.The histocompatibility，blood vessel capabilities and the degradation of the material were observed 2，4，8 and 12 weeks after surgery.ResultsThe structure of novel 3-D composite bionic network was three-dimensional and porous.The cells attached on scaffolds attached and grew well with polygonal or fusiform form.It was found that inflammatory reactions were alleviated gradually in the early stage.There was an increasing angiogenesis at late stage.Materials degraded and absorbed more slowly.ConclusionThe present study suggests that the novel 3-D composite bionic network has good histocompatibility with easy vascularization，and will be a candidate scaffold for bone tissue engineering.

neovascularization，physiologic；histocompatibility；tissue engineering；chitosan；3-D composite bionic network

R318.08

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.003

國家自然科學基金資助項目（81101448）；河北省自然科學基金資助項目（C2011401006，H2012401017）；河北省引進留學人員資助項目（C201400560）

1河北聯合大學基礎醫學院病理教研室（郵編063000）；2天津大學化工學院

崔曼（1987），女，碩士在讀，主要從事組織工程方面研究

△E-mail：xsun1@hotmail.com