環(huán)孢素A對冠心病患者T淋巴細胞CD40/CD40L表達的影響

劉歡，彭長生，胡越成，李曦銘，叢洪良△

環(huán)孢素A對冠心病患者T淋巴細胞CD40/CD40L表達的影響

劉歡1，彭長生1，胡越成2，李曦銘2，叢洪良2△

目的探討CD40/CD40L在冠心病發(fā)生發(fā)展中的作用，以及環(huán)孢素A（CsA）對CD40/CD40L是否具有抑制作用。方法71例冠心病或疑診為冠心病患者分為急性心肌梗死（AMI）組19例，不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）組18例，穩(wěn)定型心絞痛（SAP）組17例，正常對照（N）組17例。提取各組患者外周血單個核細胞（PBMCs），應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測各組CD40/CD40L表達水平，篩選出CD40/CD40L高表達組并給予不同濃度CsA（H1:0 mg/L；H2:0.01 mg/L；H3:0.1 mg/L；H4:1 mg/L）處理細胞，流式細胞術(shù)檢測處理組CD40/CD40L的表達水平。結(jié)果與N組相比，其他3組CD40表達水平均升高（均P＜0.05），UAP組、AMI組較SAP組升高，UAP組與AMI組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CD40L的表達在不同病變程度組間依次升高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。AMI組CD40/CD40L表達水平最高。不同濃度CsA處理后H1組CD40表達率高于H3組、H4組（均P＜0.05）。CD40L表達率在H1組顯著高于其他3組（均P＜0.05）。結(jié)論CD40/CD40L可能參與冠心病的發(fā)生發(fā)展，CsA可通過抑制CD40/CD40L從而延緩冠心病發(fā)展及改善預(yù)后。

冠心病；環(huán)孢素A；抗原，CD40；CD40配體；流式細胞術(shù)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）是威脅人類健康的重要疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明。研究顯示，炎癥及免疫在冠狀動脈粥樣硬化形成、斑塊不穩(wěn)定以及破裂中起著相當重要的作用［1］。CD40配體（CD40L）屬于腫瘤壞死因子超家族成員，它可表達于血小板［2］。當血小板受到炎癥因子的刺激時，活化的血小板表面表達并釋放可溶性 CD40L （sCD40L），而sCD40L通過與其受體CD40的結(jié)合促進炎癥因子表達、組織因子形成、血小板活化及血栓形成［3］。抑制炎癥反應(yīng)已成為當今冠心病預(yù)防治療領(lǐng)域的研究熱點。環(huán)孢素A（CsA）最早應(yīng)用于減輕器官移植的排斥反應(yīng)。作為一種免疫抑制藥物，它可抑制蛋白激酶C（PKC）及鈣神經(jīng)素（CN），而PKC與CN是CD40L表達所需要的首要因素［4-5］。本文主要探討CD40/CD40L和冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度的關(guān)系以及CsA對CD40/CD40L表達的影響。

1　對象與方法

1.1試驗對象選擇2013年3月—2014年1月天津市胸科醫(yī)院收治的冠心病或疑診為冠心病患者71例，按病史、心電圖、心肌損傷標志物等診斷方法將其分為4組：急性心肌梗死（AMI）組19例，不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）組18例，穩(wěn)定型心絞痛（SAP）組17例，正常對照（對照組）17例。對照組定義為有胸痛癥狀但不伴有心電圖改變以及最終冠狀動脈造影證實無冠脈狹窄的患者。排除標準：（1）確診急性心肌梗死但不處于急性期患者。（2）血流動力學不穩(wěn)定的患者。（3）患者任一免疫激素水平超過正常值范圍、既往有免疫系統(tǒng)疾病史者。（4）患有惡性腫瘤、嚴重的肝腎疾病、遺傳性高脂血癥者。（5）近3個月曾服用免疫抑制藥物或影響免疫功能的藥物者。（6）妊娠或哺乳婦女。所有入選患者均自愿參與本研究并簽署知情同意書，本研究已得到天津市胸科醫(yī)院倫理委員會的認可。

1.2試劑與儀器1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司。植物血凝素（PHA）和白細胞介素（IL）-2購自美國Sigma公司。抗人CD40單克隆抗體及抗人CD40L單克隆抗體購自美國BD公司。流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

1.3生化指標的檢測及冠脈造影結(jié)果分析采集各組試驗對象肘正中靜脈血30 mL（20 mL用于生化指標檢測，10 mL采用EDTA抗凝管收集待流式篩選），利用全自動生化分析儀分別檢測血膽固醇（CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、肌酐等生化指標。同時對所有入選患者行冠狀動脈造影檢查，其冠心病嚴重程度應(yīng)用Gensini積分系統(tǒng)進行評估［6］，計算出各患者的冠狀動脈病變狹窄程度總積分。

1.4單個核細胞的提取采用聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度離心法分離單個核細胞（PBMCs）。分離到的PBMCs懸液用5倍體積的生理鹽水洗滌2次，1 500 r/min室溫離心10 min，去掉大部分混雜的血小板，裂解紅細胞后待流式檢測。

1.5流式細胞儀檢測篩選加入2 mL Permeabilization Buffer工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。重復洗滌細胞后直接加入熒光標記抗體（抗人CD40單克隆抗體、抗人CD40L單克隆抗體）20 μL，避光4℃孵育至少30 min，加入生理鹽水500 μL上流式分析儀。分析各組CD40/CD40L表達率，篩選出CD40/CD40L表達率最高的組別。

1.6CsA處理確定CD40/CD40L高表達組后調(diào)整該組淋巴細胞濃度為2×106個/mL，每孔2 mL接種于12孔板。加入PHA（終濃度10 mg/L），IL-2（終濃度10 μg/L）刺激T淋巴細胞。分別加入不同濃度CsA（H1:0 mg/L；H2:0.01 mg/L；H3: 0.1 mg/L；H4:1 mg/L）處理。各濃度組復設(shè)3孔，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，采用流式細胞術(shù)分析各處理組的CD40/CD40L表達率。

1.7統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 18.0錄入數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。Gensini積分與CD40、CD40L表達量的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1生化指標結(jié)果4組間性別構(gòu)成、伴高血壓病比例、糖尿病比例、CHO、肌酐水平差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；年齡、Gensini積分、LDL-C、HDL-C差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

Tab.1　Comparison of clinical information between four groups of patients表1　各組患者臨床資料比較

2.2CD40/CD40L分子表達情況與對照組相比，其他 3組 CD40/CD40L的表達水平均升高（P＜0.05），AMI組CD40的表達水平與UAP組相比差異無統(tǒng)計學意義。AMI組CD40L表達水平均高于其他3組（P＜0.05），AMI組為CD40/CD40L高表達組，見表2、圖1。

Tab.2　The CD40/CD40L expression of PBMCs in four groups of patients表2各組患者PBMCs細胞CD40/CD40L表達情況　（%）

2.3Gensini積 分 與 CD40/CD40L表 達 的 關(guān)系Gensini積分與CD40、CD40L表達均呈正相關(guān)（r分別為0.725、0.732，均P＜0.01）。

2.4不同濃度CsA對AMI組CD40/CD40L表達的影響H1組、H2組的CD40表達率高于H3、H4組（均P＜0.05），H1與H2組、H3與H4組差異無統(tǒng)計學意義。CD40L表達率H1組顯著高于其他3組，H2組高于H3、H4組（均P＜0.05），H3與H4組差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

3　討論

慢性炎癥及免疫在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的作用，血液中的炎性介質(zhì)以及隨后的諸多炎性應(yīng)答可以促使冠狀動脈粥樣硬化的形成進展、血栓形成以及斑塊不穩(wěn)定性、破裂［7］。許多炎癥介質(zhì)已經(jīng)被證實參與冠心病的發(fā)生發(fā)展。

Tab.3　Effects of different levels of CsA on CD40/CD40L expression in patients with AMI表3不同濃度CsA對AMI組患者CD40/CD40L表達的影響　（n=19，%）

Fig.1　The CD40/CD40L expression of CD4+T cells in four groups of patients圖1　各組患者CD4+T細胞CD40/CD40L表達情況

CD40/CD40L系統(tǒng)是炎癥反應(yīng)中非常重要的信號轉(zhuǎn)導通路。CD40蛋白屬于腫瘤壞死因子超家族，它是一種L型跨膜蛋白，主要表達于B淋巴細胞［8］。作為CD40的配體，CD40L（也稱為CD154）也屬于腫瘤壞死因子超家族，它是一種Ⅱ型跨膜蛋白，主要表達于活化的T淋巴細胞和血小板，當機體內(nèi)某些炎癥因子如IL-1、IL-2被激活，通過激活血小板使活化了的血小板表達并分泌大量的CD40L［9］。CD40L與CD40相結(jié)合啟動炎癥反應(yīng)，促進內(nèi)皮細胞增殖、平滑肌細胞增生遷移、脂肪細胞的脂肪因子釋放，從而促進動脈粥樣硬化的形成及進展［5］。CD40/CD40L系統(tǒng)能夠誘導基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達，使粥樣斑塊的纖維帽變薄，從而導致斑塊不穩(wěn)定及破裂［10］。Zirlik等［11］發(fā)現(xiàn)sCD40L可以和巨噬細胞的整合素Mac-1相互作用從而促進炎性細胞的黏附及遷移。上述研究提示CD40/CD40L系統(tǒng)可能參與并促進動脈粥樣硬化的形成及發(fā)展，也與本項研究結(jié)果相一致。但也有研究表明，斑塊的穩(wěn)定性并不依賴于淋巴細胞上的CD40L，可能與成纖維細胞、平滑肌細胞上CD40/CD40L相互反應(yīng)有關(guān)［12］，因此臨床上通過檢測血中淋巴細胞CD40及CD40L的水平，預(yù)測斑塊的穩(wěn)定程度，以便及時采取措施，預(yù)防臨床事件的發(fā)生這一想法還未得到確切證據(jù)，但其表達的升高可能會提示冠心病的嚴重程度。

CsA是一種免疫抑制藥物，起初用于減弱器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)［4］。CsA能夠抑制蛋白激酶C、鈣神經(jīng)素，從而阻滯CD40L基因的表達以及CD40L依賴的T細胞的功能；活化的T細胞核因子（NFAT）是鈣神經(jīng)素的酶作用物，它在CD40L的表達方面可能起重要作用，CsA可以通過抑制NF-AT來抑制CD40L的表達［13］。研究表明，線粒體滲透性轉(zhuǎn)變小孔（mPTP）在心肌發(fā)生缺血時處于關(guān)閉狀態(tài)，當發(fā)生再灌注時即打開，處于開放狀態(tài)的mPTP可能引起再灌注損傷［14］。CsA作為mPTP阻斷劑，有可能減少再灌注損傷，從而改善冠心病患者預(yù)后［15］。但也有研究顯示CsA能夠通過阻斷c-jun氨基末端激酶（JNK）、p38途徑抑制T淋巴細胞的凋亡，改變血清膽固醇代謝及水平，加重動脈粥樣硬化［16］。本研究提示CsA可能通過抑制CD40L的表達在一定程度上影響冠心病的發(fā)生和發(fā)展，且提示CsA與CD40L表達可能存在劑量依賴關(guān)系。與其他研究不同的是，本研究提示CsA可能只通過CD40L途徑參與抗動脈粥樣硬化作用，由于本研究只對AMI患者進行了不同濃度CsA影響共刺激分子表達的測定，可能導致結(jié)果的偏倚，有待進行進一步多樣本分析。

綜上所述，CD40/CD40L水平的升高可能對冠狀動脈粥樣硬化的形成及發(fā)展起到一定的作用；CsA可能對冠心病的治療起到一定的臨床作用，縮小或穩(wěn)定斑塊，延緩或阻止冠心病的發(fā)展。但由于樣本量較小，Gensini積分計算的主觀性因素等可能造成試驗誤差，尚不能明確CsA是否可以對冠心病起到預(yù)防及治療作用，且不能得知單純抵抗CD40/ CD40L是否可對機體產(chǎn)生免疫系統(tǒng)紊亂等不良反應(yīng)；應(yīng)用CsA進行冠心病治療具有挑戰(zhàn)性，尚需更多大規(guī)模試驗來進行進一步探究。

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（2014-08-28收稿2014-11-03修回）

（本文編輯胡小寧）

The influence of CsA in CD40/CD40 ligand expression of T lymphocytes in patients with coronary artery disease

LIU Huan1，PENG Changsheng1，HU Yuecheng1，LI Ximing2，CONG Hongliang2△
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Cardiology，Tianjin Chest Hospital
△Corresponding Author E-mail:hongliangcong@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of CD40/CD40 ligand on the genesis and development of coronary artery disease（CAD），and the inhibitory effect of cyclosporine A（CsA）on CD40/CD40 ligand.MethodsA total of 71 patients were divided into four groups:acute myocardial infarction group（AMI，n=19），unstable angina pectoris group（UAP，n=18），stable angina pectoris group（SAP，n=17）and normal control group（N，n=17）.Flow cytometry was used to detect the expression of CD40 and CD40L in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of four groups.The group in which CD40 and CD40L were produced at the highest level was chosen，and a series concentrations of CsA（H1:0 mg/L，H2:0.01 mg/L，H3: 0.1 mg/L，H4:1 mg/L）were used to treat the cells.Then the expressions of CD40 and CD40L were measured by flow cytometry.ResultsCompared with N group，the expression of CD40 was significant higher in other groups（P＜0.05）.The expression of CD40 was significant higher in UAP group and AMI group than that of SAP group.There was no significant difference in the expression of CD40 between UAP group and AMI group（P＞0.05）.The expression of CD40L was elevated and followed by different severity of CAD.There was significant difference in the expression of CD40L between groups（P＜0.05）. AMI group showed the highest expression of CD40 and CD40L.After being treated with CsA，the expression of CD40 was higher in H1 group than that of H3 group and H4 group（P＜0.05）.The expression of CD40L was significantly higher in H1 group than that of other three groups（P＜0.05）.ConclusionCD40 and CD40L may be involved in the development of CAD.Moreover，it might be restrained by CsA via regulation of CD40/CD40L.

coronary artery disease；cyclosporine A；antigens，CD40；CD40 ligand；flow cytometry

R541.4

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.015

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃項目（11JCYBJC13500）

1天津醫(yī)科大學研究生院（郵編300070）；2天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科

劉歡（1988），男，碩士在讀，主要從事冠心病的診斷與治療等研究

△E-mail:hongliangcong@163.com