污水處理系統中硝化菌的菌群結構和動態變化

曾 薇，張麗敏，王安其，張 潔，彭永臻，段俊嶺（.北京工業大學環境與能源工程學院，北京 004；.北京城市排水集團有限責任公司，北京 00044）

污水處理系統中硝化菌的菌群結構和動態變化

曾 薇1*，張麗敏1，王安其1，張 潔1，彭永臻1，段俊嶺2（1.北京工業大學環境與能源工程學院，北京 100124；2.北京城市排水集團有限責任公司，北京 100044）

研究分析了4種不同工藝類型的城市污水處理廠中氨氧化細菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）的豐度及菌群結構.實時定量PCR結果表明4種工藝中AOB菌群的豐度范圍為8.56×106～4.46×107cells/gMLSS；NOB菌群的豐度為3.37×108～1.53×109cells/gMLSS.每個工藝中Nitrospira都是優勢NOB，占NOB菌群的88% 以上. A2O工藝冬季AOB和Nitrospira豐度比夏季均有所降低，這是導致冬季生物脫氮效果變差的主要原因.基于 amoA基因的系統發育分析結果顯示所有的序列屬于Nitrosomonas，其中Nitrosomonas oligotropha cluster 占克隆文庫的60.1%，是 AOB 種群中的優勢菌屬，Nitrosomonas-like cluster和 Nitrosomonas europaea cluster次之，分別占克隆文庫的29.6%和9.1%.N. europaea cluster只在A2O工藝中出現，且在A2O工藝夏季污泥樣品克隆文庫中達到44.7%.低DO運行使N. europaea cluster成為優勢 AOB是 A2O工藝夏季出現較高亞硝酸鹽積累率的主要原因.研究結果證實了城市污水處理廠中優勢 AOB和 NOB分別為Nitrosomonas和Nitrospira，硝化菌群占總菌群的1%～7%，其豐度、相對含量和菌群結構是影響硝化效果的主要因素.

氨氧化細菌（AOB）；亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）；城市污水處理廠（WWTPs）；實時定量PCR （QPCR）；amoA基因

生物脫氮已廣泛應用于城市污水處理廠，硝化作用是生物脫氮的首要環節，其功能微生物包括將氧化為的氨氧化細菌（AOB）和將氧化為的亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）［1］.AOB菌群主要屬于變形菌綱的β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria兩個亞綱［2］，其中β亞綱分為亞硝化單胞菌群（Nitrosomonas）和亞硝化螺菌群（Nitrosospira）.NOB主要有硝化桿菌屬（Nitrobacter）、硝化螺菌屬（Nitrospira）、硝化刺菌屬（Nitrospina）及硝化球菌屬（Nitrococus）［3］.硝化菌群的豐度和菌群結構直接影響污水處理廠的硝化效果.

近年來，不依賴于純培養的分子生物學分析方法成為研究污水處理系統硝化菌群的主要技術［4-6］.已有研究證實絕大多數的生物反應器里Nitrosomonas是AOB中的優勢菌屬，而Nitrosospira只出現在個別反應器里［2，7-8］.對于NOB菌群，以前一直認為Nitrobacter是污水生物處理系統中亞硝酸鹽氧化的主導者［9］.也有研究者認為自然環境中的 NOB以 Nitrobacter和Nitrospira類型為主，其中 Nitrobacter是土壤中NOB的主導類型，而Nitrospira在污水生物處理系統中分布較為廣泛［10］.后來的一些研究表明Nitrospira和Nitrobacter均存在于城市污水處理廠［11］，但是發現 Nitrospira 在污水生物處理系統中更為常見且數量高于Nitrobacter［12］.由此可見，城市污水處理系統中 NOB 的優勢菌群因工藝類型和運行參數的不同而具有各自的特征.很多實際污水處理系統中的硝化細菌對環境因素以及工藝參數非常敏感，例如溫度、DO、水力停留時間（HRT）以及抑制劑等因素均可以影響硝化細菌的組成［13-15］.以往對硝化菌群的定量分析主要集中AOB菌群的研究上［16］，關于NOB的定量分析，尤其是 NOB的兩個亞屬 Nitrospira和Nitrobacter的定量研究非常有限.本研究通過對不同工藝的城市污水處理廠中AOB、NOB的定量分析，考察工藝類型及運行條件對 AOB和NOB（Nitrospira和Nitrobacter）豐度的影響.

基于16S rRNA和amoA基因的現代分子生物學方法為復雜環境中AOB的多樣性以及菌群結構分析提供了有力的手段［17-19］.氨單加氧酶（Ammonia monooxygenase， AMO）是氨氧化菌所特有的一種胞內酶，由amoA、amoB和amoC 3個亞基組成，其中 amoA的基因產物含有該酶的活性位點.很多學者對不同AOB菌株的amoA基因和16S rRNA基因進行測序和系統發育樹分析后，發現大部分AOB在分別基于amoA基因和16S rRNA基因的系統發育樹上的分類有著高度的相似性［19-21］，但 amoA基因類引物的擴增特異性更強，對 AOB菌群遺傳差異的分辨能力更高［18，22］.本研究基于amoA基因建立系統發育樹，能夠將AOB菌群進行更為細致精確的分類.

本研究選擇具有代表性的大型市政污水處理廠，分析不同工藝的城市污水處理廠活性污泥中AOB和NOB菌群結構和代謝活性的差異，揭示污水處理廠AOB和NOB菌群結構、豐度與工藝運行的相關性.

1　材料與方法

1.1城市污水處理廠的活性污泥樣品

表1　4個污水處理系統的進出水水質指標及運行參數Table 1 Influent and effluent characteristics and operation parameters of four WWTPs

實驗所用的 5個污泥樣品均取自二沉池回流污泥，命名為： A、B、C、D-S（夏季樣品）、D-W（冬季樣品）.A、B、C、D-S取樣時間為夏季7月，D-W為冬季2月份.A和B取自同一水廠不同工藝：A是倒置A2O工藝，缺氧段位于前端，優先考慮脫氮效果，即：缺氧-厭氧-好氧方式運行；B是AO工藝，采用缺氧-好氧技術；C取自卡魯賽爾氧化溝工藝；D-S和D-W取自同一工藝的夏季和冬季，工藝為傳統的A2O工藝，即厭氧-缺氧-好氧.各個工藝進出水水質指標及運行參數見表1.

1.2DNA提取、PCR、克隆測序

用1×PBS清洗污泥樣品3次，14000×g離心2min（離心機：MIKRO 22 R，德國Hettich），去除上清液，置于-20℃保存.采用試劑盒（Fast DNA Spin kit for soil， MP， USA）對DNA進行提取，提取后的DNA 通過 Nanodrop Spectrophotometer ND-1000 （Thermo Fisher Scientific， USA）測量核酸濃度及純度.

PCR 反應采用試劑盒（Promega GoTaq Green Master Mix， USA），反應體系為 25μL：12.5μL GoTaq Green Master Mix，1μL （10mmol/L）正向引物，1μL （10mmol/L）反向引物，0.5～2μL DNA模板，一定量的ddH2O.PCR程序見表2.

表2　PCR擴增程序及特異性引物Table 2 Specific primers and PCR programs

amoA的 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳（Agarose MS-6，TaKaRa，Japan）檢測，為單一的目的條帶，切膠，用純化試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0TaKaRa， Japan ）進行純化.純化后的 DNA用試劑盒（Zero Background TA Topoisomerase Cloning Kit， Clonesmarter， USA）進行連接轉化，連接體系為 10μL，包括 1μL pCloneEZ-TOPO 載體，1μL 10×Enhancer， 0.5～8μLDNA，一定量的用 ddH2O.連接反應完成后將產物加入到感受態細胞DH5a（中美泰和，國產）中進行轉化.每個樣品隨機挑出50個amoA基因的陽性克隆子進行測序，構建克隆文庫.

1.3克隆文庫建立和系統發育分析

構建文庫的序列通過Mothur軟件按照97%相似度進行OTU劃分，將每個OTU的代表序列與NCBI數據庫中利用BLAST下載的相似性最高最具代表性的菌株序列一起進行比對.采用MEGA5.0利用鄰接法（Neighbor joining method）進行系統發育分析，通過自舉分析方法（Bootstrap）檢驗系統發育樹各分支置信度，重復1000次.

1.4實時定量PCR （QPCR）

采用特異性引物對AOB amoA功能基因，隸屬于NOB菌群的Nitrospira和Nitrobacter以及全菌的 16S rRNA進行 QPCR擴增.反應在Mx3005P實時定量PCR擴增儀（Agilent Technologies，American）上進行，采用試劑盒（ SYBR Premix Ex Taq kit，TaKaRa，Japan）進行反應，體系為25μL包括12.5μL的SYBR緩沖液，正反向引物各 1μL（10mmol/L），0.5μL ROX，DNA模板 2μL，一定量的 ddH2O.采用試劑盒（MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，TaKaRa，Japan）回收質粒.

標準曲線的建立：用 NanoDrop ND-1000（Thermo，American）分光光度計測定回收質粒的濃度（MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，TaKaRa，Japan）.將純化后的質粒以10倍的濃度梯度稀釋用作QPCR標準品.反應在Mx3005P實時定量PCR擴增儀（Agilent Technologies，American）上進行，采用試劑盒（SYBR Premix Ex Taq kit，TaKaRa，Japan）進行反應，體系為25μL.

1.5登錄號

本研究所測得的AOB序列上傳至GenBank數據庫，AOB的序列登錄號為：KR018127-KR018368.

2　結果與討論

2.1AOB與NOB的實時熒光定量PCR分析

AOB、NOB （Nitrobacter和Nitrospira） 和總菌的實時熒光定量PCR的標準曲線的效率都在90%～110%之間，相關系數均大于0.998，特異性和擴增效率都符合精確定量的要求.標準品分別如下：AOB 為 8.55×101～8.55×108拷貝，Nitrobacter為1.05×102～1.05×109拷貝， Nitrospira 為 1.31×102～1.31×109拷貝，總菌為 4.98×101～4.98×108拷貝.

表3為AOB和NOB絕對定量和相對定量的結果.5個污泥樣品中總菌豐度在一個數量級上，定量范圍為 1.10×1010（B）～9.27×1010（D-S）cells/gMLSS.硝化菌群在總菌中的百分含量大約為1%-7%.AOB種群數量AO工藝（B）最低，為8.56×106cells/gMLSS，其它 4個污泥樣品在1.20×107～4.46×107cells/gMLSS之間.倒置A2O工藝 （A樣品）AOB占總菌比例最高為0.3%，其他3個工藝在0.02%～0.08%之間.結合表1的進出水水質指標可以看出倒置A2O工藝的出水氨氮濃度最低（0.72mg/L），硝化效果最好.因此，AOB在總菌中的相對含量決定了水廠的硝化效果. Nitrospira在 D-S中豐度最高，達到了 1.53× 109cells/gMLSS，占總菌比例為1.64%，在其他3個工藝中數量級均為 108cells/gMLSS，占總菌比例為 1.36%～6.12%之間.Nitrobacter除了在樣品D-S中豐度為零外，其余在 1.69×107～6.78× 107cells/gMLSS之間，占總菌比例為 0.15%～0.39%之間.D-W中的總菌、AOB、Nitrospira豐度較D-S均有所降低，但Nitrobacter卻由0增加到 1.45×107cells/gMLSS.冬季樣品（D-W）中硝化菌群豐度和百分含量的降低可能是很多城市污水處理廠冬季脫氮效果變差的主要原因.

表3　總菌、AOB和NOB的實時定量結果Table 3 QPCR results of bacteria， AOB and NOB

本研究AOB amoA基因定量分析的數量級大致在107～108cells/gMLSS之間，與已有的多數研究結果基本一致［7，24-25］，但略低于個別研究［26-27］.對 NOB定量結果顯示本研究中的城市污水處理系統中Nitrospira是NOB菌群中的優勢菌屬，豐度要比Nitrobacter高出一個數量級.關于AOB和NOB豐度，有的研究認為AOB和NOB在同一個數量級［16］，也有研究發現AOB豐度比NOB低一個數量級［28］.從表3可以看出，本研究的水廠中 AOB種群豐度要比 NOB （Nitrobacter和 Nitrospira）低一個數量級.除了樣品 D-S（A2O工藝），其他工藝的 Nitrospira和Nitrobacter均存在，且相差一個數量級，只有樣品D-S中Nitrobacter含量為0.結合表1中D-S出水的和，計算出亞硝積累率為24%，由此推斷采用A2O工藝的D水廠在夏季可能出現了短程硝化現象，并且在向短程硝化轉化的過程中，Nitrobacter先于 Nitrospira被淘汰.結合表 1的運行參數發現D-S的溶解氧要明顯低于其他3個工藝，低溶解氧可能是造成短程硝化的原因之一.進入冬季，由于水溫降低，短程硝化向全程硝化轉化，Nitrobacter又出現在D-W樣品中.

2.2基于OTU的AOB系統發育分析

5個amoA基因克隆文庫中共得到242條amoA序列，按照 97%的相似度劃分為 21個OTUs.5個污泥樣品構建的 amoA基因克隆文庫的Good覆蓋率、Chao1豐富度估計、OTU值與估計的 Chao1值之比、香農指數見表4. 5個污泥樣品的amoA基因的OTU分布如圖1所示.

表4　amoA基因克隆文庫的序列多樣性及覆蓋率Table 4 Sequences diversity and Good coverage of amoA gene clone libraries

圖1　5個污泥樣品中AOB amoA基因的OTU分布Fig.1 Relative distribution of OTUs based on amoA genes in 5samples

如表 4所示，Good覆蓋率最低的是 DS74.47%，但其OTU值與估計的Chao1值之比達到89%.OTU值與估計的Chao1值之比最低的是樣品C75%，其Good覆蓋率達到了93.88%.這兩組數據說明這2個amoA克隆文庫可以代表2個污水處理廠AOB的群落組成.樣品A和B的 Good覆蓋率均在 90%以上，OTU值與估計的Chao1值之比均為 100%.與D-S比較，D-W的OTU值與估計的Chao1值為87.76%，明顯高于D-S（74.47%），數據可信度更高.高景峰等［29］對 10個污水處理系統中的 AOB菌群進行研究，Good覆蓋率在 65.4%～100%之間，說明本研究建立的amoA克隆文庫可以代表每個污水處理廠中AOB群落組成.表4計算了5個amoA基因克隆文庫中的香農指數，根據表中結果發現C樣品中amoA基因多樣性要低于其他樣品，香農指數只有0.2.另外4個樣品的香農指數在0.67～2.16之間，對比其他研究可說明本研究的 5個樣品的AOB 群落多樣性在正常范圍之內［24-25，29］，其中D-S多樣性最豐富.從圖1和表4可以看出，樣品C僅有3個OTU，且有2個OTU各僅含有1條序列，意味著樣品C中的AOB多樣性最不豐富.雖然樣品A和B所含OTUs數分別為4和3，但從圖1可以看出，每個樣品所含序列較均勻的分布在各個 OTU，因此具有一定的生物多樣性水平；樣品D-S含有10個OTUs，多樣性水平最高，與表4的香農指數分析一致. D-W共有6個OTU，其中有4個OTU與D-S是重復覆蓋的，說明雖然污水處理系統溫度發生了變化，OTU分布會有一定變化，但其優勢OTU得以保留.

圖2　基于amoA基因的AOB系統發育樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of AOB group based on amoA genes

利用21個OTUs中的代表序列建立的NJ系統發育樹如圖2所示.從圖2可以看出有11個OTU屬于N. oligotropha，有 6個OTU 屬于N. europaea cluster，有2個OTU屬于Nitrosomonaslike cluster，有2個OTU （僅包括3條序列）屬于N. marina 和N. aestuarii.其中OTU1、OTU2、OTU3分別含有58、47、28條序列，是AOB菌群的優勢OTU，屬于N. oligotropha和Nitrosomonas-like cluster.

2.3AOB的系統發育樹分析

5個污泥樣品中AOB種群分布以及相對含量如圖3所示.基于 amoA基因的系統發育分析結果（圖2）顯示所有的序列屬于Nitrosomonas，沒有發現Nitrosospira cluster.AOB的分布從多到少分 別 為 ：N. oligotropha、 Nitrosomonas-like cluster、N. europaea cluster、N.matina and N.aestuarii cluster.其中Nitrosomonas oligotropha cluster和Nitrosomonas-like cluster是AOB種群中的兩大優勢菌群，分別占克隆文庫的60.08%和29.63%，與已有研究結果一致［2，30］.從圖 3可以看出，除了樣品B中N.oligotropha cluster僅為2%，其余4個樣品都含有N.oligotropha cluster且含量豐富.其中樣品C所有的 AOB amoA序列以及樣品D-W中97.96%的AOB amoA序列都屬于N.oligotropha cluster.其 他2個 樣 品 中N.oligotropha cluster占克隆文庫的比例在40.43%～60.42%之間.Nitrosomonas-like cluster分布在3個樣品中，并且在樣品B中所占比例達到98%，在樣品A和D-S中所占比例分別為39.58% 和 8.51%，在樣品 C和 D-W 中未檢測到.N. europaea cluster占克隆文庫的 9.05%，只在采用A2O工藝的樣品D-S和D-W中發現，這可能與該A2O工藝進水氨氮濃度相對較高有關.而且N. europaea cluster在夏冬兩季樣品中的百分含量發生明顯的變化，D-S中 N. europaea cluster占AOB總量的 44.68%，是優勢 AOB菌屬，但在D-W樣品中降到了2.04%.在其他3個工藝中并未檢測到N. europaea cluster.另外，在D-S樣品中發現了少量的N.matina和N.aestuarii cluster.

比較樣品D-S和D-W的AOB群落結構，一個明顯的變化特征是進入冬季后，原本處于優勢的N. europaea cluster明顯減少，而N. oligotropha cluster顯著增多，達到AOB總量的98%.因此，冬季水廠硝化效果變差的原因除了與硝化菌群豐度降低有關，還可能與上述AOB群落結構的變化有關.如前所述，樣品D-S所在的污水處理廠夏季出現較高的亞硝酸鹽積累率，這可能與夏季樣品中N. europaea cluster的優勢地位有關；冬季隨著短程現象的消失，N. europaea cluster含量減少.有研究認為N. europaea 有優先利用亞硝酸鹽作為電子受體的能力［30-31］，經過低 DO馴化的短程硝化活性污泥中以N. europaea為主［32］.從表1可以看出，4種工藝中，D-S樣品所在的A2O工藝 DO值最低，僅為 1.8mg/L，遠低于其他 3種工藝（3～6mg/L）.而且只有A2O工藝（D-S和D-W）中出現了N. europaea，并在樣品D-S克隆文庫中所占比例達到44.69%.冬季短程硝化逐漸變為全程硝化，隸屬于NOB的Nitrobacter重新出現，同時系統內N. europaea cluster大量消失，在樣品D-W中僅占AOB總量的2%.由此可以推測低DO運行使N. europaea成為優勢AOB可能是D-S出現短程硝化的原因.

圖3　5個污泥樣品中AOB種群分布以及種群相對含量Fig.3 Phylogenetic distribution and relative abundance of AOB groups in 5samples

3　結論

3.1本研究的城市污水處理廠活性污泥樣品中優勢 AOB和 NOB分別為 Nitrosomonas和Nitrospira.硝化菌群達到總菌群的 1%～7%，其豐度，尤其是 AOB在總菌中的相對含量決定了系統的硝化效果.AOB豐度比NOB豐度低一個數量級.NOB菌群中的Nitrospira豐度比Nitrobacter豐度高一個數量級，是明顯的優勢NOB.

3.2本研究的活性污泥樣品中的 AOB全部隸屬于Nitrosomonas，其中N. oligotropha cluster是AOB 中的優勢菌屬，占克隆文庫的 60%. Nitrosomonas-like cluster次之，占克隆文庫的30%. N. europaea cluster只出現在A2O工藝中. 3.3 A2O工藝冬季AOB和Nitrospira豐度的降低是導致冬季生物脫氮效果變差的原因.A2O工藝夏季污泥樣品中N. europaea cluster占該克隆文庫的 44.7%，是優勢 AOB.低 DO運行使 N. europaea cluster成為優勢AOB是A2O工藝夏季出現較高亞硝酸鹽積累率的主要原因.

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Community structures and population dynamics of nitrifying bacteria in activated sludges of wastewater treatmentplants.

ZENG Wei1*， ZHANG Li-min1， WANG An-qi1， ZHANG Jie1， PENG Yong-zhen1， DUAN Jun-ling2（1.College of Environmental and Energy Engineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China；2.Beijing Drainage Group Limited Liability Company， Beijing 100044， China）.

China Environment Science， 2015，35（11）：3257～3265

Community structures and population dynamics of nitrifying bacteria determine biological nitrogen removal from municipal wastewater. The population structures and dynamics of ammonia-oxidizing bacteria （AOB） and nitrite-oxidizing bacteria （NOB） in four full-scale wastewater treatment plants （WWTPs） were investigated in this study. Quantitative real-time PCR results showed that the abundance of AOB was in a range of 8.56×106～4.46×107cells/gMLSS，while NOB was varying in 3.37×108～1.53×109cells/gMLSS. In each process Nitrospira was the dominant species of NOB. Nitrospira abundance was obviously higher than Nitrobacter， accounting for 88% of total NOB. In the A2O process the abundances of AOB and Nitrospira in winter were less than those in summer， leading to decline of biological nitrogen removal. The phylogenetic analysis of AOB amoA genes indicated that all the sequences were affiliated with genera Nitrosomonas， among which Nitrosomonas oligotropha cluster was the dominant species， accounting for 60% of the clone libraries. The pre-dominant AOB were Nitrosomonas-like cluster and Nitrosomonas europaea cluster， accounting for 29.6% and 9.1% of the clone libraries， respectively. N. europaea cluster was only found in A2O process， and reached 44.7% of total AOB in summer sample， which was a main reason causing high nitrite accumulation during summer operation of A2O process. The outcomes verified that the dominant AOB and NOB in WWTPs was Nitrosomonas and Nitrospira， respectively. Nitrifying bacteria accounted for 1%～7% of total bacteria. The abundances， relative distributions and community structures of nitrifying bacteria significantly influence the performance of biological nitrogen removal.

ammonium oxidizing bacteria （AOB）；nitrite oxidizing bacteria （NOB）；wastewater treatment systems （WWTPs）；real-time quantitative PCR （QPCR）；amoA genes

X703

A

1000-6923（2015）11-3257-09

2015-04-03

國家自然科學基金項目（51278007，51578016）；教育部新世紀優秀人才支持計劃項目（NCET-11-0891）

* 責任作者， 教授， zengwei_1@263.net

曾 薇（1974-），女，黑龍江省哈爾濱人，教授，博士，主要從事污水生物處理研究.發表論文70余篇.