紅樹莓原液對免疫抑制小鼠臟器指數及血清IFN-γ、IL-4水平的影響

于曉紅，李書丹，闞洪敏，宋　娜，孫　力（.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱50040；.西安市第八醫院，西安70060；.哈爾濱市兒童醫院，哈爾濱5000）

紅樹莓原液對免疫抑制小鼠臟器指數及血清IFN-γ、IL-4水平的影響

于曉紅1，李書丹1，闞洪敏2，宋娜3，孫力1
（1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱150040；2.西安市第八醫院，西安710060；3.哈爾濱市兒童醫院，哈爾濱150010）

［目的］觀察紅樹莓原液對免疫抑制小鼠的免疫調節作用，探討紅樹莓原液提高機體免疫功能的作用機制。［方法］測定紅樹莓原液對免疫抑制小鼠脾臟、胸腺指數的影響。應用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測免疫抑制小鼠血清γ-干擾素（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）水平及計算IFN-γ/IL-4比值。［結果］紅樹莓原液對免疫抑制小鼠脾臟和胸腺指數下降有明顯抑制作用，可顯著提高小鼠血清IFN-γ、IL-4水平，降低IFN-γ/IL-4比值。［結論］紅樹莓原液對免疫抑制小鼠具有免疫增強作用。

紅樹莓原液；免疫抑制；臟器指數；γ-干擾素；白介素-4

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.03.11

紅樹莓，薔薇科Rasaceae懸鉤子屬Rubus．L半灌木性聚合漿果植物，作為中藥材應用已有數千年的歷史，是中藥覆盆子家族的一員，俗稱“托盤”、“刺莓”等。藥典記載：覆盆子甘、酸、溫；歸肝、腎、膀胱經；有益腎固精縮尿，養肝明目之效。民間紅樹莓也被廣泛食用，其果實柔嫩多汁，酸甜可口，具有止渴、活血及抗腫瘤等功效，已被人們作為良好的防病保健水果。目前對于紅樹莓的研究大多集中于其有效成分的開發或致力于國內種植方法的研究等［1-4］，而對于其免疫藥理作用研究未見報道。基于本課題組前期研究基礎，依據紅樹莓新鮮果實中含有多種生物活性物質，推斷紅樹莓作用于生物體將產生一定的免疫藥理作用，此項研究將擁有廣闊發展前景［5-7］。本課題組就紅樹莓對機體免疫調節機制從分子、基因等水平進行了一系列的實驗研究，本研究擬就紅樹莓原液對免疫抑制模型小鼠臟器指數、血清Th1、Th2型細胞因子含量的影響進行前期報道，旨在闡述紅樹莓原液對機體的免疫調節作用，關于其他免疫學指標的測定及免疫機制的研究課題組將陸續加以報道。

1　實驗材料

1.1實驗動物及分組選用健康昆明系小鼠60只（購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，許可證號：黑醫實驗動物單項準第61號。雌雄各半，體質量為（18.0±2.0）g，采用隨機數字表法隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組（甘露聚糖肽4 mg/kg）、紅樹莓原液低劑量組（10 g/kg）、紅樹莓原液中劑量組（20 g/kg）、紅樹莓原液高劑量組（40 g/kg）。

1.2藥物1）紅樹莓原液：紅樹莓采摘于黑龍江省尚志市帽兒山，鮮果洗凈、自然干燥、搗碎（不添加蒸餾水）、抽濾去滓，獲得濃度為1.1 g/mL紅樹莓原液。臨用時倍比稀釋成不同濃度的紅樹莓液。2）環磷酰胺注射液：購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司（批號：H32026196）。3）甘露聚糖肽：購于貴州神奇制藥有限公司（批號：H52020862）。

1.3主要試劑小鼠γ-干擾素（IFN-γ）、白介素-4 （IL-4）檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，蒸餾水、生理鹽水、PBS粉等均購于哈爾濱博潤生物科技公司。

2　實驗方法

2.1給藥方法及劑量自實驗第1日起，紅樹莓原液低、中、高劑量組分別給予稀釋不同濃度的紅樹莓藥液0.4 mL/d灌胃，正常對照組和模型組給予蒸餾水0.4 mL/d灌胃，陽性對照組給予甘露聚糖肽0.4 mL/d灌胃，連續30 d，灌胃期間自由進食。

2.2動物模型制備除正常對照組外，其余各組均于實驗第9日起腹腔注射環磷酰胺50 mg/kg，隔日注射，連續22 d，共注射11次，正常對照組同法給予生理鹽水腹腔注射。

2.3標本采集及檢測

2.3.1紅樹莓原液對免疫抑制小鼠免疫器官的測定將剝離的胸腺和脾臟，用電子分析天平稱質量，按公式計算胸腺指數和脾指數。臟器指數=臟器濕重/小鼠體質量。

2.3.2紅樹莓原液對免疫抑制小鼠血清Th1、Th2型細胞因子的測定于末次給藥后12 h，摘眼球取血約0.6～1.0 mL，靜置30 min，離心（3 000 r/min，15 min），取上清液，移入EP管中，采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測血清中IFN-γ、IL-4水平，嚴格按照試劑盒說明書操作，繪制標準曲線，計算血清中IFN-γ、IL-4含量。

2.4統計學方法數據采用統計軟件SPSS18.0處理，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析（one-way-ANOVA），組間兩兩比較，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

3　實驗結果

3.1紅樹莓原液對免疫抑制小鼠胸腺、脾臟指數的影響與正常對照組比較，模型組胸腺指數、脾指數均明顯降低，具有統計學差異（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組與紅樹莓原液中劑量組均可以升高胸腺指數、脾指數，具有統計學差異（P＜0.05或P＜0.01），紅樹莓原液低劑量組亦可顯著升高脾指數，具有統計學差異（P＜0.01）；紅樹莓原液不同劑量組與陽性對照組比較均無統計學差異（P＞0.05）；紅樹莓原液中劑量組胸腺指數高于紅樹莓原液低劑量組及紅樹莓原液高劑量組，具有統計學差異（P＜0.05），紅樹莓原液不同劑量組脾指數比較，均無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1　小鼠胸腺指數、脾指數比較Tab.1　Comparison of the thymus and spleen indexmg/g

表1　小鼠胸腺指數、脾指數比較Tab.1　Comparison of the thymus and spleen indexmg/g

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05；紅樹莓原液各組間比較，#P＜0.01，##P＜0.05。

組別n胸腺指數脾指數正常對照組101.490±0.4126.580±1.758模型組100.400±0.205*3.460±0.753*陽性對照組100.680±0.213▲▲4.820±1.141▲低劑量組100.500±0.1864.460±0.802▲中劑量組100.680±0.180▲▲##4.660±1.274▲高劑量組100.500±0.1953.930±0.892

3.2紅樹莓原液對免疫抑制小鼠血清Th1、Th2型細胞因子的影響紅樹莓原液對免疫抑制小鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4比值的影響見表2，結果表明，模型組IFN-γ、IL-4含量明顯低于正常對照組，比較有統計學差異（P＜0.01），經紅樹莓原液給藥后，IFN-γ、IL-4水平均呈現升高趨勢，與模型組比較有統計學差異（P＜0.01或P＜0.05）；與正常對照組比較，模型組小鼠血清IFN-γ/IL-4比值明顯升高，比較有統計學差異（P＜0.05），經紅樹莓原液給藥后，小鼠血清IFN-γ/IL-4比值呈下降趨勢，與模型組比較有統計學差異（P＜0.01或P＜0.05）；其中紅樹莓原液中劑量組對以上指標療效均接近陽性對照組，比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2　紅樹莓原液對血清IFN-γ、IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值的影響Tab.2　Measuring the effect of Red Raspberries juice on serum IFN-γ，IL-4 content and the ratio of IFN-γ/IL-4

表2　紅樹莓原液對血清IFN-γ、IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值的影響Tab.2　Measuring the effect of Red Raspberries juice on serum IFN-γ，IL-4 content and the ratio of IFN-γ/IL-4

注：與正常對照組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.01，△△P＜0.05。

組別nIFN-γ（ng/L）IL-4（ng/L）IFN-γ/IL-4正常對照組10 62.700±8.34322.460±3.1182.830±0.482模型組10 30.980±3.630*8.140±1.759*3.960±0.902**陽性對照組10 52.180±7.886▲20.820±3.675▲2.600±0.733▲低劑量組10 47.300±5.213▲12.890±2.607▲△3.850±1.115▲△中劑量組10 53.790±7.833▲18.620±3.135▲2.910±0.255▲▲高劑量組10 43.570±4.731▲▲△△11.670±3.220▲▲△4.020±1.301▲▲△

4　討論

許多疾病的發生、發展與機體免疫功能下降密切相關。機體的免疫系統是一個巨大的網絡系統，有賴于免疫器官、組織、細胞和分子等的協調作用。本實驗通過觀察小鼠免疫器官（胸腺、脾臟）的生長發育情況，計算其臟器指數，初步反映出紅樹莓原液對免疫抑制機體的免疫調節作用［8-10］。結果顯示：紅樹莓原液中劑量組對免疫抑制小鼠的胸腺發育有一定促進作用，與模型組比較有統計學差異；紅樹莓原液低劑量組及紅樹莓原液中劑量組對免疫抑制小鼠的脾臟發育具有明顯的促進作用，與模型組比較有統計學差異。以上結果表明紅樹莓原液可通過促進小鼠胸腺及脾臟等免疫器官的發育，起到上調免疫功能的作用［11-12］。

免疫細胞可通過誘導而合成、分泌細胞因子等生物活性物質，在人體生理、病理過程中發揮重要作用，并且參與調節免疫平衡。根據CD4+T細胞所產生的細胞因子種類和介導功能的不同，可將其分為TH1、TH2和Tr細胞。TH1型細胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12和TNF-β/α等TH1型細胞因子，TH2型細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等TH2型細胞因子，TH1、TH2型細胞因子是否維持平衡狀態是機體免疫功能發揮正常與否的重要因素［13-15］。在TH1/TH2平衡失調中以TH1或TH2型細胞因子的優勢應答均可誘發疾病［16-18］。調節TH1/TH2失衡狀態，在多種疾病的診治過程中將起到重要作用［19-20］。

本實驗對小鼠采取腹腔注射環磷酰胺方法制備免疫抑制模型，其血清IFN-γ、IL-4水平較正常對照組明顯降低，IFN-γ/IL-4比值較正常對照組明顯升高，成功模擬了免疫抑制機體TH1/TH2失衡狀態，給予紅樹莓原液治療后可不同程度升高血清IFN-γ、IL-4含量，并可下調IFN-γ/IL-4比值，糾正IFN-γ/ IL-4（TH1/TH2）失衡狀態，并使之恢復接近正常，說明紅樹莓原液可促進血清IFN-γ、IL-4細胞因子分泌，起到正向免疫調節作用，并可通過糾正TH1/TH2失衡，達到治療免疫抑制性疾病的作用。

綜上所述，本實驗以環磷酰胺制備免疫抑制模型為基礎，通過觀察紅樹莓原液對小鼠臟器指數及血清IFN-γ、IL-4水平的影響，初步探討紅樹莓原液的免疫增強作用，為紅樹莓的保健食用及臨床研發提供理論依據。

［1］劉建華，張志軍，李淑芳.樹莓中功效成分的開發淺論［J］.食品科學，2004，25（10）：370-373.

［2］徐雅琴，張睿，付紅.紅樹莓中黃酮類物質超聲波提取及純化的研究［J］.食品工業科技，2007，28（4）:130-132.

［3］王文芝.樹莓果實營養成分初報［J］.西北園藝，2001，25（2）:13-14.

［4］李小萍，辛秀蘭，劉亞紅，等.紅樹莓果實中鞣花酸的提取工藝研究［J］.食品工業科技.2010，31（1）:277-279.

［5］徐玉秀，王友升，王貴禧.樹莓的利用研究及其在我國的發展前景［J］.經濟林研究，2003，21（1）：64-66.

［6］Morimoto C，Satoh Y，Hara M，et a1.Anti-obeseaction of raspberry ketone［J］.Life Sci，2005，77（2）：194-204.

［7］鄭文科，商洪才.中醫藥在防治腫瘤中的特色和優勢［J］.天津中醫藥大學學報，2010，29（3）：166-168.

［8］許丹妮，李健，馬玉芳，等.金線蓮多糖對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖及免疫器官的影響［J］.中獸醫醫藥雜志，2011，13（3）：15-17.

［9］張玉萍，方步武，吳咸中.大承氣顆粒藥物血清對小鼠腸上皮內淋巴細胞增殖的作用［J］.天津中醫藥大學學報，2007，26（3）：143-145.

［10］吳維佳，龐璐，胡日紅，等.鐵皮石斛對小鼠免疫功能的影響［J］.湖南中醫雜志，2012，28（2）:113-114.

［11］付彥君，張效禹.昆布提取物對小鼠免疫功能及抗疲勞能力的影響［J］.天津中醫藥大學學報，2013，32（4）:214-216.

［12］Gu WZ，Su WH，Zhou LX，et al.Two-way immune Therapy-unionapplication of immune suppression and immune modulator［J］. Aerospace Medicine，2004，15（1）：52-53.

［13］劉志嚴.小青龍湯對變應性鼻炎大鼠IL-4和IFN-γ含量的影響［J］.遼寧中醫藥大學學報，2011，13（10）:249-251.

［14］張偉鋒，劉寶山.穿龍薯蕷皂苷對障礙再生性貧血小鼠骨髓T細胞亞群的影響［J］.天津中醫藥大學學報，2011，30（3）：160-162.

［15］許玲.銀杏葉提取物對樹突狀細胞和Th1/Th2細胞因子的影響［J］.醫藥論壇雜志，2006，27（6）：35-37.

［16］Murphy KM，Reiner SL.Thelineagedecisions ofhelper Tcells［J］.Nat Rev Immunol，2002，2（12）:933-944.

［17］Neurath MF，Finotto S，Glimcher LH.The role of IL-4/IFN-r polarization inmucosal immunity［J］.Nat Med，2002，8（4）:567-573.

［18］張西波，李忠廉.扶正益氣中藥對阻塞性黃疸患者外周血清炎癥介質和Th1/Th2的影響［J］.天津中醫藥，2013，30（8）:459-461.

［19］袁穎，金素安，何世民.中藥對Th1/Th2細胞因子平衡調節作用的研究進展［J］.上海中醫藥雜志，2011，45（5）：90-93.

［20］張茜薇，宋卓敏，王娜，等.痛經寧顆粒調節Th1/Th2型細胞因子治療原發性痛經的臨床研究［J］.天津中醫藥，2013，30（5）：281-281.

（本文編輯：高杉，馬曉輝）

Influence of Red Raspberry on IFN-γ，IL-4 levels and immunosuppressed mice organs index

YU Xiao-hong1，LI Shu-dan1，KAN Hong-min2，SONG Na3，SUN Li1
（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.The No.8 Hospital of Xi’an，Xi’an 710060，China；3.Children’s Hospital of Harbin，Harbin 150010，China）

［Objective］By observing immunosuppressive effects of Red Raspberries juice in immunosuppressed mice，investigate mechanism of Red Raspberry improves immunological function.［Methods］The spleen and thymus index of immunosuppressed mice were detected.The IFN-γ and IL-4 levels of serum in mice were detected by ELISA method and th IFN-γ/IL-4 ratio were calculated.［Results］Red Raspberries juice has significant inhibitory effects on immunosuppressed mice thymus and spleen index declined；and the serum IFN-γ and IL-4 levels were significantly increased，IFN-γ/IL-4 ratio markedly decreased.［Conclusion］Red Raspberries juice had a certain effect on heightening immunity.

Red Raspberries juice；immunosuppression；organs index；IFN-γ；IL-4

R285.5

A

1672-1519（2015）03-0173-03

于曉紅（1958-），女，教授，碩士生導師，主要從事中醫藥對機體免疫調節及抗腫瘤作用機制研究。

孫力，E-mail：sunli@hljucm.net。

（2014-11-02）