靈芝抗腫瘤作用的免疫學機制及其臨床應用

林志彬（北京大學醫學部基礎醫學院藥理學系，北京 100191）

前沿論壇

靈芝抗腫瘤作用的免疫學機制及其臨床應用

林志彬
（北京大學醫學部基礎醫學院藥理學系，北京 100191）

靈芝的抗腫瘤作用與其免疫調節作用密切相關。本文在我們的研究工作的基礎上，結合國內外文獻論述靈芝抗腫瘤作用的免疫學機制，包括靈芝促進單核巨噬細胞和自然殺傷細胞功能；促進樹突狀細胞成熟、分化和抗原提呈功能；活化淋巴細胞、增強細胞毒T細胞的功能及促進細胞因子的生成；抑制腫瘤細胞的免疫逃逸反應；以及靈芝免疫治療的基礎研究等。涉及免疫學指標的靈芝的臨床研究結果也一并介紹。

靈芝屬；多糖類；抗腫瘤藥，植物；免疫調節；腫瘤逃逸；治療應用

林志彬，教授，博士生導師。歷任北京醫科大學基礎醫學院副院長兼基礎醫學研究所所長和藥理學系主任，北京醫科大學副校長。先后在美國芝加哥伊利諾斯大學做訪問學者、俄羅斯彼爾姆藥學院任名譽教授和香港大學訪問教授。歷任國際藥理學聯合會執委會委員和提名委員會委員、國際靈芝研究學會主席、中國科學技術協會全國委員會委員、中國藥理學會理事長和名譽理事長、國家新藥研究與開發專家委員會委員、國家藥典委員會委員和國家藥品審評專家等。任《北京醫科大學學報》主編和Acta Pharmacol Sin等雜志副主編。長期從事抗炎、免疫調節、內分泌和抗腫瘤藥物研究，是國內外著名的靈芝研究學者。曾獲國家教委科技進步二等獎和三等獎，北京市科技進步二等獎和三等獎，教育部提名國家科技進步獎二等獎及微生物文教基金會（臺北）卓越成就獎等。1992年享受國務院政府特殊津貼。

靈芝是國內外久負盛名的中藥。2000多年前出版的《神農本草經》中，將靈芝列為有效無毒的“上藥”并列出靈芝（赤芝、青芝、白芝、黃芝、黑芝和紫芝）的性味歸經與功效。2000年開始，《中華人民共和國藥典》一部收載靈芝〔赤芝，Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.〕和紫芝（Ganoderma sinensis Zhao，Xu et Zhang）子實體作為法定中藥材。現代植物化學、藥理學、毒理學和臨床研究表明，靈芝含有多糖、三萜、甾醇和小分子蛋白等多種有效成分，具有廣泛的藥理作用，毒性極低，臨床用于治療多種疾?。?］。

筆者所在研究室自20世紀70年代開始研究靈芝及其有效成分的藥理作用，近20年來，著重研究靈芝的免疫調節作用和抗腫瘤作用及其機制。大量研究結果表明，靈芝的抗腫瘤作用與其免疫調節作用密切相關［2］。本文在我們的研究工作基礎上，結合國內外文獻論述靈芝抗腫瘤作用的免疫學機制及其臨床應用。

1 靈芝抗腫瘤作用的發現

Ito等［3］、Kin等［4］、Miyazaki等［5］、Mizuno等［6-7］、Lee等［8］、Sone等［9］、Maruyama等［10］、Furusawa等［11］及Ma［12］先后報道，靈芝（G.lucidum）子實體提取物及其所含多糖腹腔注射或灌胃給藥，可顯著抑制小鼠移植性腫瘤的生長，并認為靈芝的體內抗腫瘤作用可能是“宿主中介性的”，即通過增強機體的免疫功能而實現的。為了證明這一假設，從20世紀90年代起，我們重復了靈芝的體內抗腫瘤實驗。結果發現，靈芝子實體水提取物（G.lucidum extract，GLE）及其靈芝多糖B（G.lucidum polysaccharide B，GL-B）和多糖肽（G.lucidum polysaccharide peptide，GLPP）、破壁孢子多糖（G.lucidum broken spore polysaccharides，GL-BSP）灌胃可明顯抑制小鼠移植性腫瘤S180肉瘤、人肺癌（PG）和Lewis肺癌的生長，但直接加到體外培養的S180肉瘤、人白血病HL-60細胞和PG細胞的培養液中，不能直接抑制腫瘤細胞生長，也不能促進腫瘤細胞凋亡，提示靈芝提取物和多糖在體內的抑制腫瘤生長并非直接細胞毒作用，而增強機體的抗腫瘤免疫力可能是其中重要的一環［13-18］。

2 靈芝抗腫瘤作用的免疫學機制

2.1 血清藥理學研究靈芝的宿主中介性抗腫瘤作用

血清藥理學實驗是中藥藥理研究的一種方法，即給實驗動物灌服中藥提取物或組分后，取其血清（含藥血清）進行體外藥理實驗。含藥血清中可能含所服中藥或其活性代謝產物，也可能含有在中藥作用下產生的內源性活性物質，并因此產生藥理作用。據此，我們給小鼠灌胃不同劑量的GLE 5，10和20 g（相當生藥）·kg-1或GL-B 50，100和200 mg·kg-1，共10 d，最后一次給藥后1 h取血，無菌分離血清，經56℃，30 min滅活處理后，用微孔濾膜過濾除菌。將此含藥血清加至體外培養的S180細胞或HL-60細胞培養基中，則可明顯抑制兩種腫瘤細胞生長，并可誘導其凋亡［13-15］。

由于未能在含藥血清中檢出靈芝的多糖成分，我們推測小鼠灌服GLE或GL-B后，血清中可能出現了一種內源性抗腫瘤活性物質。于是采用生物法和ELISA法檢測含GLE或GL-B血清的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素γ （interferon-γ，IFN-γ）的含量。結果顯示，不同劑量GLE或GL-B灌胃小鼠，血清中TNF-α的活性和IFN-γ的水平增加，并呈現明顯的劑量依賴關系［13-15］。已知TNF-α和IFN-γ對腫瘤細胞均具有細胞毒作用，能殺滅腫瘤細胞，TNF-α在體外可誘導多種腫瘤細胞凋亡，而IFN-γ還可與TNF-α協同作用，增強TNF-α誘導腫瘤細胞凋亡的作用。因此，含GLE或GL-B血清在體外抑制腫瘤細胞生長和促進腫瘤細胞凋亡的作用至少與其中所含TNF-α和IFN-γ有關，而后二者是在GLE或GL-B作用下由體內生成的。

為了在體外模擬血清藥理學的實驗結果，又分別在小鼠腹腔巨噬細胞或脾細胞培養液中，加入GL-B（50，100和200 mg·L-1）共同培養24 h，然后分別取GL-B與巨噬細胞或脾細胞共培養上清液，加至HL-60細胞培養基中，結果這兩種共培養上清液可顯著抑制HL-60細胞增殖和促進其凋亡［14-15］。同樣，靈芝菌絲體多糖與小鼠腹腔巨噬細胞共培養上清液也可顯著抑制HL-60細胞增殖，并促其凋亡［16］。進一步的研究結果表明，GL-B能使小鼠腹腔巨噬細胞培養上清液中TNF-α mRNA表達和TNF-α水平增加，也能使小鼠脾細胞培養上清液中IFN-γ mRNA表達和IFN-γ水平增加［19］。同樣，靈芝菌絲體多糖與小鼠腹腔巨噬細胞共培養上清液中TNF-α的水平亦明顯增加［20］。這些結果均說明靈芝多糖確能直接作用于巨噬細胞和脾細胞，促其產生TNFα和IFNγ，抑制腫瘤細胞生長。

給小鼠灌胃GLE 5，10和20 g（相當生藥）·kg-1，共10 d，也可顯著增加小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α mRNA表達和脾細胞IFNγ mRNA表達［13］。

Wang等［21］研究也證明，將靈芝子實體多糖（PS-G）直接加到人白血病細胞HL-60和U937細胞培養液中，對此兩種細胞增殖均無抑制作用，也不能誘導其凋亡。但在健康人外周血單核-巨噬細胞或T淋巴細胞培養中加入PS-G，可明顯促進巨噬細胞生成白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β），TNF-α和IL-6，促進T淋巴細胞生成IFN-γ。當PS-G濃度為100 mg·L-1時，IL-1β，TNF-α和IL-6分別較對照增加5.1，9.8和29倍。加入20%PS-G與人外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，MNC-CM）共培養，則可顯著抑制HL-60和U937細胞增殖，并促進其凋亡。此外，在HL-60和U937細胞培養液中加入20%PS-G與MNC-CM培養液（PS-G-MNC-CM）可誘導HL-60和U937細胞分化為成熟的可表達CD14和CD18表面抗原的單核-巨噬細胞，分化率分別為40%和45%。

Li等［22］亦發現，靈芝多糖GLB7（5，10，20和40 mg·L-1）能濃度依賴性地誘發小鼠腹腔巨噬細胞IL-1α和TNF-α mRNA的表達，并增強巨噬細胞培養上清中IL-1α和TNF-α活性。

最近我們發現，GL-BSP（50，100和200mg·kg-1）灌胃給藥，可顯著抑制小鼠S180肉瘤生長，但對體外培養的S180或PG細胞增殖無直接抑制作用。將灌胃上述劑量GL-BSP的小鼠血清加到體外培養的S180或PG細胞中，則可劑量依賴性地抑制腫瘤細胞增殖。研究還發現，與正常對照血清比較，含GL-BSP血清中IL-2，TNF-α，IFN-γ和一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）水平顯著增加，表明含GL-BSP血清抑制S180和PG細胞增殖與IL-2，TNF-α和IFN-γ等免疫細胞因子有關。為了進一步證實含GL-BSP血清中TNF-α和IFN-γ的抗腫瘤活性，我們把經過TNF-α和（或）IFN-γ中和抗體預處理過的含GL-BSP血清加入S180或PG細胞培養液中，結果其抑制腫瘤細胞增殖的作用顯著減弱，尤以同時加入TNF-α和IFN-γ中和抗體的含GL-BSP血清減弱作用更為明顯。進一步研究發現，S180荷瘤小鼠與正常小鼠比較，其自然殺傷細胞（natural killer cells，NK）細胞的細胞毒活性、巨噬細胞吞噬活性、輔酶A和脂多糖誘導的脾淋巴細胞增殖功能明顯降低，CD4+/CD8+比值顯著升高，灌胃GL-BSP則可使這些改變恢復至接近正?；蛲耆Ｋ?。

這些研究結果有力證明，GL-BSP的體內抗腫瘤作用與其促進免疫細胞因子產生，增強NK細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的功能有關［18］。

2.2 靈芝促進樹突狀細胞的成熟和分化，增強其功能

樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是一種抗原遞呈細胞（antigen presenting cells，APC），能高效地攝取、加工處理和提呈抗原。成熟的DC高表達主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ-抗原肽復合物和MHC-Ⅱ-抗原肽復合物以及B7-1/CD80，B7-2/CD86，CD40和LFA-3/CD58等共刺激分子，這些分子與T淋巴細胞結合并激活T淋巴細胞。此外，DC高表達細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）/CD54和ICAM-3/CD50等黏附分子，有利于與T淋巴細胞的進一步結合?？乖岢适且粋€雙向過程，一方面，DC可誘導T淋巴細胞活化；另一方面，DC可接受已活化T淋巴細胞反饋回來的活化信號如CD40L而活化，表達共刺激分子并分泌其他活化因子如IL-12，誘導Th1型應答的生成。DC作為激發T淋巴細胞免疫反應的重要輔助細胞，在初次抗體反應、混合淋巴細胞培養、促有絲分裂反應及抗腫瘤免疫應答中均具有重要作用。

2002年，我們首先發現在小鼠骨髓源性DC體外培養體系中，加入0.8，3.2或12.8 mg·L-1的靈芝多糖（GL-PS，系從赤芝子實體中提取的含17種氨基酸的多糖，相對分子質量為584.9×103，多糖∶肽=93.51∶6.49。多糖部分是由葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖組成），可明顯促進DC表面DC11c及I-A/I-E分子的共表達、明顯增加IL-12 40亞基mRNA和蛋白表達、促進DC誘導的混合淋巴反應，表明靈芝多糖能促進DC的成熟、分化并增強其功能。在DC誘導P815腫瘤細胞裂解物沖擊致敏小鼠產生的特異性細胞毒T淋巴細胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）模型中，于沖擊致敏階段，加入不同濃度的GL-PS共培養，收集CTL及細胞培養上清液，以釋放入CTL與P815腫瘤細胞共培養體系細胞培養上清液中的乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）的活性代表CTL的特異性殺傷活性；同時用RT-PCR法檢測CTL中IFN-γ及顆粒酶B（granzyme B）的mRNA表達；用ELISA法檢測細胞培養上清液中IFN-γ蛋白含量；用Western蛋白印跡法檢測CTL表達的顆粒酶B蛋白含量。結果顯示，當DC經P815腫瘤細胞凍融抗原沖擊致敏后，其誘導產生的CTL對P815腫瘤細胞具有殺傷作用，GL-PS（0.8，3.2和12.8 mg·L-1）可增強此作用，表現為釋放入培養上清液中的LDH活性顯著增強。進一步研究發現，同上濃度的靈芝多糖可明顯增加DC誘導CTL的IFN-γ mRNA表達，并使培養上清液中IFN-γ蛋白含量增加。我們還發現，上述濃度的靈芝多糖可明顯增加DC誘導的CTL的顆粒酶B mRNA及蛋白表達。這些結果提示，靈芝多糖在DC成熟階段，增強DC對腫瘤抗原的捕獲、處理、提呈能力，增強DC誘導的特異性CTL的細胞毒活性。而靈芝多糖促進活化CTL的IFN-γ mRNA轉錄及蛋白表達，使IFN-γ生成增加，后者通過其直接和間接作用發揮抑瘤作用。顆粒酶為淋巴細胞絲氨酸蛋白酶類，通常以非活化的酶原形式貯存于CTL和NK胞質內的細胞毒顆粒中，并于脫顆粒時釋出，促進CTL及NK細胞介導的細胞凋亡。顆粒酶家族中，以顆粒酶B功能最強。靈芝多糖促進CTL的顆粒酶B mRNA和蛋白質表達，與其增強CTL的細胞毒活性有關［23-24］。

Lin等［25］報道，具有（1→6）-β-D-葡聚糖分支結構的靈芝多糖（PS-G）（10 mg·L-1）能促進人單核細胞來源的DC表達CD80，CD86，CD83，CD40，CD54和人白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-DR，以及IL-12和IL-10 mRNA及其蛋白表達，抑制DC的內吞活性。PS-G還增強DC刺激T細胞的活性，促進T細胞分泌IFN-γ和IL-10。由于抗Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體可抑制PS-G誘導的IL-12和IL-10的分泌，提示TLR4參與PS-G對DC的上述作用。進一步研究顯示，PS-G能增加κB抑制劑（inhibitor of κB，IκB）激酶和NF-κB活性，以及IκBa和P38絲裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）的磷酸化。而helenalin（NF-κB的抑制劑）以及SB98059（P38 MAPK的抑制劑）可不同程度地阻斷PS-G對DC表達CD80，CD86，CD83，CD40，CD54和HLA-DR，以及IL-12和IL-10生成的作用。提示PS-G是通過NF-κB和P38 MAPK信號通路，誘導人DC的活化和成熟。

Lin等［26］進一步研究發現，重組靈芝菌絲體中提取的免疫調節蛋白（rLZ-8；由110個氨基酸殘基組成，相對分子質量為12.4×103）處理人單核細胞，衍生的DC細胞表面表達的CD80，CD86，CD83和HLA-DR增加，IL-12 p40，IL-10和IL-23生成亦增加，DC細胞的內吞減少，TLR4抗體能阻斷IL-12 p40和 IL-10生成的增加。同時rLZ-8能刺激TLR4或TLR4/MD2-轉染的HEK293細胞表達IL-8。進一步研究提示，rLZ-8能升高IKK和NF-κB的活性，增加IκBα和MAPK的磷酸化，NF-κB抑制劑菊內酯能不同程度地阻斷CD80，CD86，CD83 和HLA-DR的表達以及IL-12 p40和IL-10的生成。體內實驗表明rLZ-8增加BALB/c小鼠IgG2a，IFN-γ和IL-2的生成。表明LZ-8促進DC細胞成熟和活化，增強Th1反應。Zhou等［27］還發現，在環磷酰胺致白血病模型中，rLZ-8增強中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞活性，也增加CD4+T細胞百分率以及IL-3和IL-4的生成。

Chan等［28］的研究證明，GL-PS也能刺激單核細胞源性DC成熟。GL-PS和GM-CSF/IL-4共同作用誘導THP-1細胞轉化為典型的DC細胞形態，而GL-PS單獨作用只能誘導THP-1細胞增殖。此外，THP-1轉化為DC引起HLA-DR，CD40，CD80 和CD86表達顯著增高，抗原攝取能力亦增加。然而，它誘導同種異體T細胞增殖的能力較弱。

Meng等［29］發現，靈芝多糖GLP能增加小鼠DC表達CD86，CD40以及MHC-Ⅱ，促進DC細胞表型成熟。GLP下調DC內的酸性磷酸酶活性，減少吞噬，增強抗原提呈，IL-12生成也顯著增加。

Yoshida等［30］報道，靈芝水溶性提取物（0.01，0.1和1.0 g·L-1）能活化DC，促進前炎癥細胞因子TNF-α和IL-23大量生成，增強IL-23p19轉錄以及細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）磷酸化。IL-23p19啟動子活性檢測和MEK抑制劑U0126反向抑制實驗結果指出，MEK-ERK信號通路參與靈芝提取物活化DC。靈芝提取物活化的DC能促進CD4+T細胞增殖，在混合淋巴細胞反應中靈芝提取物活化Th17細胞，生成大量IL-17，同時亦分泌較多IL-4，提示靈芝提取物不僅促進Th17細胞分化，還促進Th2細胞的分化。進一步對靈芝提取物的主要組分β-葡聚糖（curdlan）和肽聚糖（peptidoglycan，PGN）的研究發現，β-葡聚糖激活的DC細胞分泌大量IL-23和IL-10；而PGN誘導TNF-α和IL-23的活性較弱，生成較多的IL-1β。體內實驗表明，給小鼠連續口服靈芝提取物（每只鼠10 mg），每2日1次，共4周，與對照組相比，各種消化道相關淋巴組織中的Th17細胞百分率均不同程度地增加，Foxp3+調節T細胞也增加。靈芝提取物還增加小腸的IL-17下游分子IL-17A和IL-17F及其誘導的防御素（defensin）生成。結果表明，靈芝提取物及其所含β-葡聚糖在體內外活化DC，生成大量IL-23，誘導Th17細胞分化。這一作用可能與其在腸道的抗微生物活性有關。

Yue等［31］發現，紫芝熱水提取物400 mg·L-1能明顯刺激人外周血單核細胞增殖。紫芝子實體的菌柄多糖（50～400 mg·L-1）能濃度依賴性地激活外周血單核細胞。TNF-α，IL-10和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）生成增加，CD14+單核細胞百分比增加，單核細胞源性DC IL-10和IL-12生成增加。

2.3 靈芝增強免疫細胞殺傷腫瘤細胞的活性

2.3.1 靈芝增強單核巨噬細胞活性

單核吞噬細胞系統（mononuclear phagocyte system，MPS）是體內具有強烈吞噬及防御功能的細胞系統，也是一類抗原提呈細胞，在特異性免疫應答的誘導與調節中發揮重要作用。它們共同起源于造血干細胞，在骨髓中分化發育，經幼稚單核細胞發育成為單核細胞，隨循環血流進入結締組織和其他器官，轉變成巨噬細胞。除了吞噬細菌等外來病原，還可吞噬自身細胞（如枯否細胞吞噬紅細胞）、腫瘤細胞、抗原抗體復合物、蓄積的脂質等，并可在吞噬外來抗原后與輔助T細胞進行抗原提呈，釋放刺激免疫系統其他細胞或其他抗原提呈細胞的物質，活化特異性免疫反應。

早在20世紀80年代初，我們即發現從靈芝子實體中提取的靈芝液和靈芝多糖D6均能提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力，吞噬百分率和吞噬指數均較對照組顯著增高［32］。隨后，高斌和楊貴貞［33］、顧立剛等［34］、Cao等［35］及唐慶九等［36］均報道，平蓋靈芝（樹舌，Ganoderma applanatum）多糖、薄蓋靈芝（Ganoderma capense）液、GL-PS和靈芝孢子粉堿提多糖均能促進小鼠巨噬細胞的吞噬功能和IL-1的生成。

Hsu等［37-38］的體外實驗發現，靈芝多糖促進人中性粒細胞吞噬和遷移活性，通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/Akt信號通路，抑制自發性Fas介導的中性粒細胞凋亡；時間依賴性地增強人中性粒細胞蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）、P38 MAPK以及酪氨酸激酶Lyn活性，這些作用可能與其促進非特異性免疫功能有關。

Chien等［39］報道，靈芝水提取物中分離得到的含巖藻糖的多糖肽組分（F3）（10～100 mg·L-1）體外作用于人臍血單核細胞（mononuclear cells，MNC）培養7 d后，用流式細胞儀進行細胞表型分析表明，CD14+CD26+單核/巨噬細胞、CD83+CD1a+DC和CD16+CD56+NK細胞較對照組分別增加了2.9，2.3和1.5倍，并且NK細胞的細胞毒活性（效應細胞∶靶細胞=20∶1）提高了31.7%，而B細胞則無明顯變化。

唐慶九等［40］報道，靈芝活性多糖（GLIS）能顯著刺激巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β，并產生大量的NO，增強小鼠巨噬細胞對乳膠顆粒的吞噬功能。對荷瘤小鼠的巨噬細胞的上述作用強于正常小鼠。GLIS是一種糖蛋白，其中，碳水化合物＞90%，由8種單糖組成，主要為半乳糖、葡萄糖和甘露糖，比例為2∶4∶1.5，相對分子質量約2×106。

Zhang等［41］報道，給BALB/c小鼠接種S180肉瘤細胞，從脾和脛骨/股骨分別分離淋巴細胞和骨髓衍生的巨噬細胞，檢測GLIS對這些細胞的影響以及抗腫瘤效果。結果GLIS能活化荷瘤小鼠脾分離的B淋巴細胞，促進其增殖和生成IgG。同樣GLIS也能活化荷瘤小鼠的骨髓源性巨噬細胞，并且生成IL-1β，TNF-α和活性氮中間體，如NO。GLIS顯著增強巨噬細胞吞噬功能，顯著提高巨噬細胞介導的腫瘤細胞毒性。GLIS可使小鼠肉瘤S180生長抑制60%。

Wei等［42］發現，GLPS不僅增強了巨噬細胞J774A.1表面的TLR4和CD14表達，以及脂多糖結合和細胞內吞作用，而且也降低了黏附時間常數，提高了結合相互作用的力常數。

Watanabe等［43］報道，在體外THP-1單核細胞培養中，加入富含赤芝酸（lucidenic acid）的鹿角狀靈芝（antlered form of G.lucidum）提取物（AF）可促進TNF-α生成，并可協同脂多糖誘導TNF-α生成。它還可促進脂多糖誘導的P38 MAPK磷酸化，抑制脂多糖誘導的c-Jun N端激酶（N-kinase，JNK）MAPK磷酸化。從AF中純化的赤芝酸-A和赤芝酸-F分別可調節JNK和P38 MAPK活性，從而增強脂多糖誘導的免疫應答。

Zhang等［44］發現，黑靈芝多糖（G.atrum polysaccharides，PSG-1）不能直接殺傷結腸癌CT26細胞，而是通過激活腹腔巨噬細胞而抑制其增殖。同時觀察到荷瘤小鼠的脾質量指數和胸腺指數增加，TNF-α，IL-1β和NO生成增加，并發現PSG-1作用于TLR-4，并通過P38 MAPK信號途徑，激活NF-κB，從而刺激TNF-α的生成。

Huang等［45］從荷S180肉瘤小鼠分離出腹腔巨噬細胞，并在體外培養，RT-PCR法和ELISA法檢測巨噬細胞TNF-α mRNA表達和生成，在培養液中加入PSG-1可濃度依賴性地促進巨噬細胞的TNF-α mRNA表達和生成。實驗還證明，PSG-1的這一作用由NF-kB，PI3K/Akt和MAPK信號通路介導，并被NF-kB，PI3K/Akt和MAPK特異性抑制劑明顯抑制。

李明春等［46］采用激光掃描共聚焦顯微鏡技術動態監測小鼠腹腔巨噬細胞胞漿游離Ca2+濃度（［Ca2+］i）的變化，發現靈芝多糖組分GLB7（20mg·L-1）引起巨噬細胞中［Ca2+］i明顯升高。用EGTA螯合細胞外鈣，并用維拉帕米阻斷細胞鈣通道，然后以GLB7 20 mg·L-1刺激巨噬細胞，仍可見［Ca2+］i明顯升高，但升高幅度明顯低于未用EGTA和維拉帕米處理。在外液無鈣介質中，相同濃度的GLB7刺激巨噬細胞，亦能引起［Ca2+］i升高，而后維持在高峰平臺期。于此期再加入含鈣的緩沖液，可見［Ca2+］i明顯升高，并出現另一更高的平臺。這些均說明，GLB7引起的小鼠腹腔巨噬細胞［Ca2+］i升高是由細胞外鈣內流和細胞內鈣釋放共同作用的結果，并進一步證明此作用是通過IP3受體和蘭尼堿（ryamodine）受體兩種機制升高［Ca2+］i。GLB7引起巨噬細胞中［Ca2+］i升高可能與GLB7增強巨噬細胞功能有關。他們還采用反相離子對高效液相色譜法測定小鼠腹腔巨噬細胞中PKC活性，GLB7（40 mg·L-1）能引起小鼠腹腔巨噬細胞中PKC活性明顯升高。它還可引起巨噬細胞中PKC發生質膜轉位，并拮抗PKC抑制劑星狀孢子素對PKC的抑制作用，表明靈芝多糖的免疫增強作用與其增強PKC活性有關［47］。

我們發現，GLPP在體內外對叔丁基氫過氧化物（ter-butylhydroperoxide，tBOOH）和四氧嘧啶所致小鼠腹腔巨噬細胞氧化損傷有保護作用。光鏡和電鏡結果可見，注射GLPP可提高細胞存活率，明顯改善氧化損傷引起的巨噬細胞形態學改變，如抑制巨噬細胞膜樣變性和壞死，保護細胞膜微絨毛和細胞器（如線粒體）免遭tBOOH損傷，并使因自由基損傷而降低的巨噬細胞線粒體膜電位恢復［48］。另外，我們用四氧嘧啶和tBOOH為氧化劑，分別在小鼠體內體外損傷小鼠腹腔巨噬細胞，以DCHF-DA為熒光指示劑，用共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞的熒光變化，并用共聚焦顯微鏡作時間系列掃描，觀察巨噬細胞熒光的動態變化，研究GLPP對小鼠腹腔巨噬細胞氧自由基的清除作用。結果發現，靜脈注射四氧嘧啶（75 mg·kg-1）或體外加入tBOOH （7.76×10-5mol·L-1）均可造成小鼠腹腔巨噬細胞的氧化損傷，使巨噬細胞的熒光密度增加。給小鼠灌胃GLPP或將其加入體外培養的巨噬細胞中，均可使巨噬細胞熒光密度減少，損傷減輕［49］。共聚焦顯微鏡時間系列掃描顯示，隨時間改變，GLPP可減少靜息狀態下小鼠腹腔巨噬細胞熒光密度，也可減少12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇酯（50 nmol·L-1）誘導的呼吸爆發狀態下小鼠腹腔巨噬細胞熒光密度。結果表明，GLPP具有抗氧化作用，對氧化劑損傷小鼠腹腔巨噬細胞產生的自由基有清除作用［50］。

Cheng等［51］應用基因芯片技術比較了赤芝和紫芝的乙醇提取物對人單核細胞基因表達的影響。0.2%赤芝和紫芝提取物與人單核細胞培養24 h后，引起差異表達的基因數分別為：紫芝提取物1189個，赤芝醇提物629個，二者共有的差異表達的基因167個。這些基因影響廣泛，主要包括參與細胞生長發育（21%）細胞過程中的負調控（≈16%）細胞蛋白代謝過程（≈16%）信號轉導（≈14%）以及轉錄（≈14%）。紫芝主要作用于與炎癥和免疫反應有關的基因，赤芝則適度地增加了參與大分子代謝的基因表達。此外，這兩種靈芝的醇提物都不抑制單核細胞增殖。表1所示為兩種靈芝共同影響的10個上調和10個下調的常見基因，其中已知功能的基因多數與介導炎癥和免疫反應有關。表明靈芝作用的方式是復雜的，不同種靈芝調節人類細胞的不同靶點。

表1 紫芝和赤芝提取物共同影響的20個常見基因

2.3.2 靈芝增強自然殺傷細胞活性

NK是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關，而且在某些情況下對多種靶細胞有自發性細胞毒活性的效應，參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生。

Won等［52］采用51Cr標記的YAC-1細胞為靶細胞，與脾NK細胞（效應細胞）作用后，以靶細胞釋放51Cr的百分數檢測NK細胞的細胞毒活性。給正常C3H/HeN小鼠口服、腹腔注射、靜脈注射靈芝水萃取物再經乙醇萃取后的醇不溶性成分（GL-AI）可增強脾NK細胞的細胞毒活性。腹腔注射的最適劑量為20～40 mg·kg-1，劑量過低或過高增強作用減弱。與此同時，給藥小鼠的血清IFN滴度亦明顯增加。進一步研究發現，給C57BL/6小鼠或C3H/HeN小鼠接種黑色素瘤B16-F10和肝肉瘤129P后2周，荷瘤小鼠的脾NK細胞的細胞毒活性顯著降低，腹腔注射GL-AI 40 mg·kg-1，可明顯增強荷瘤小鼠NK細胞的細胞毒活性。Won等［53］給小鼠腹腔注射松杉靈芝（Ganoderma tsugae）水提取物（4～200 mg·kg-1）或不溶于乙醇的靈芝提取組分（GTI，1～50 mg·kg-1），呈劑量依賴性地促進NK細胞的細胞毒活性，而溶于乙醇的松杉靈芝提取組分則無此作用。寧安紅等［54］給予荷瘤小鼠腹腔注射靈芝多糖（1 mg·d-1），連續7 d，與對照組比較，明顯提高荷瘤小鼠NK細胞活性、淋巴細胞增殖反應及血清中TNF-α和IL-2的含量。

小鼠一次性腹腔注射免疫抑制藥環磷酰胺300 mg·kg-1制備免疫抑制小鼠模型，24 h后分別腹腔注射Gl-PS 2.5，25和250 mg·kg-1，每天1次，連續7d。與生理鹽水對照組比較，GL-PS2.5mg·kg-1組免疫抑制模型小鼠，其受抑制的骨髓細胞、紅細胞、白細胞、脾NK以及NKT細胞數的恢復時間明顯縮短，造模后第5天GL-PS 2.5 mg·kg-1組的CTL活性、第7～9天NK細胞、淋巴因子激活殺傷細胞（lymphokine activated killer，LAK）活性以及第12天巨噬細胞吞噬和細胞毒活性均顯著升高［55］。

Chang等［56］給BALB/c小鼠腹腔注射單核細胞型白血病WEHI-3細胞后，給小鼠連續口服靈芝提取物（3和6 mg·kg-1）28 d，可見小鼠脾質量降低，外周血單核細胞的吞噬作用和NK細胞活性增強；靈芝處理組能緩解CD3+和CD19+百分率的降低，抑制Mac-3和CD11b百分率的升高，促進Con A刺激的脾細胞增殖，對LPS刺激無顯著影響，提示先導T 和B細胞被誘導，而巨噬細胞被抑制。

Tsai等［57］報道，以酸水解的方法分別獲得靈芝多糖的兩種主要溶于水的組分：肽聚糖GLPS-SF1（相對分子質量約20 ku，葡萄糖∶甘露糖≈4∶1）和寡糖GLPS-SF2（相對分子質量1～5 ku）。這兩種組分（100 mg·L-1）都可誘導人外周血單核細胞、T淋巴細胞和NK細胞表面的CD69表達，不同程度地促進外周血單核細胞的Th1型細胞因子IL-12，IL-2，TNF-α和IFN-γ產生。在CD14+單核細胞，GLPSSF1誘導CD80/CD86共刺激分子和IL-12，TNF-α能力更強；GLPS-SF1能通過TLR4受體及其信號通路活化小鼠巨噬細胞（HeNC2）生成TNF-α。以蛋白酶K水解去除肽鏈后，剩余的GLPS-SF1多糖部分仍具有免疫活性。GLPS-SF2能特異性地活化和促進NK細胞和T細胞增殖，并能誘導IL-2，IFN-γ以及更高水平的IL-2產生。

2.3.3 靈芝增強細胞因子誘導殺傷細胞活性

將人外周血淋巴細胞在體外與多種細胞因子共培養后，獲得一群異質細胞即細胞因子誘導殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK），它們具有增殖力強、殺瘤活性高、殺瘤譜廣及對多藥耐藥腫瘤細胞同樣敏感等特點，是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。

我們按常規方法制備的CIK細胞（在小鼠脾細胞培養中，加入IFN-γ 1000 kU·L-1+抗CD3抗體50 μg·L-1+IL-2 300 kU·L-1+IL-1 100 kU·L-1，培養15 d，收獲CIK細胞）。結果可見，CIK細胞對體外培養的YAC-1和P815腫瘤細胞有明顯的細胞毒作用。在CIK細胞培養中，加入GL-PS（100和400 mg·L-1）可明顯降低IL-2和抗CD3單抗的用量（分別為未加多糖的常規CIK細胞對照組的75%和50%），但與常規CIK細胞對照組相似，能誘導和大量擴增CIK細胞，且此CIK細胞在體外對YAC-1和P815腫瘤細胞的殺傷率亦與常規對照組無明顯差異。將此CIK細胞靜脈輸注給荷S180或荷H22肝肉瘤小鼠后，其體內抗腫瘤療效與常規CIK細胞治療組比較亦無差異。我們還發現，GL-PS在降低抗CD3單抗和IL-2用量50%和75%的條件下，能促進CIK細胞顆粒酶B以及穿孔素mRNA和蛋白的表達。這表明GL-PS通過增加顆粒酶B和穿孔素的表達，從而增強CIK細胞殺傷腫瘤細胞的活性。進一步實驗還表明，GL-PS對CIK細胞的作用經由淋巴細胞表面的補體3型（CR3）受體介導［58-59］。

2.4 靈芝抑制腫瘤細胞的免疫逃逸

腫瘤的免疫逃逸是指腫瘤細胞可通過多種方式逃避免疫系統的監控、識別與攻擊而繼續分裂生長。腫瘤的免疫逃逸機制復雜，主要涉及機體全身或局部免疫功能低下，腫瘤細胞表面MHC類分子及協同刺激分子表達異常，腫瘤細胞產生免疫抑制性因子，腫瘤細胞Fas表達的抗宿主免疫等。

2.4.1 靈芝促進B16F10黑素瘤細胞MHC-Ⅰ分子和協同刺激因子的生成

通常，腫瘤抗原肽與腫瘤細胞表面的MHC-Ⅰ分子結合形成復合物，再與T細胞表面的抗原受體結合，活化T細胞并殺傷腫瘤細胞。這一過程還需要B7-1和B7-2等協同刺激分子與T細胞表面的CD28分子結合。而惡性腫瘤細胞常表現為MHC-Ⅰ分子和協同刺激分子的低表達或不表達，這是構成腫瘤免疫逃逸的重要機制。最近，Sun等［60］報道了GL-PS對B16F10黑素瘤細胞MHC-Ⅰ分子和協同刺激因子的影響。B16F10黑素瘤細胞MHC-Ⅰ分子和B7-1及B7-2分子表達不足或不表達，在B16F10黑素瘤細胞培養液中加入GL-PS可促進這些分子的表達。RT-PCR檢測結果顯示，與RPMI 1640培養基對照組相比，不同濃度GL-PS作用48 h，GL-PS可使B16F10黑素瘤細胞MHC-Ⅰ分子H-2Kb和H-2DbmRNA表達增加，也可使B7-1 和B7-2 mRNA表達增加；流式細胞術檢測結果顯示，GL-PS可使H-2Kb，H-2Db，B7-1和B7-2分子表達增強。此外，GL-PS（200，400和600 mg·L-1）作用下的B16F10黑素瘤細胞與PHA活化的小鼠脾淋巴細胞共培養，淋巴細胞介導的抗B16F10細胞毒活性較對照組明顯提高［60］。

用不同濃度GL-PS作用抗原提呈功能低下的B16F10黑素瘤細胞，再與淋巴細胞混合培養，發現與RPMI 1640培養基對照組相比，GL-PS 200和400 mg·L-1可使淋巴細胞增殖活性升高，并使淋巴細胞活化抗原CD69的表達增強，GL-PS 400 mg·L-1可促進淋巴細胞FasL的表達及IFN-γ的生成［61］。

上述結果表明，GL-PS可促進B16F10黑素瘤細胞MHC-Ⅰ分子和協同刺激因子生成，因而促進淋巴細胞活化，增強淋巴細胞介導的細胞毒性。

2.4.2 靈芝抑制B16F10黑素瘤細胞分泌免疫抑制因子

已知腫瘤細胞可產生多種免疫抑制分子，抑制免疫細胞的功能，逃避機體免疫系統的攻擊。IL-10，TGF-β和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）為腫瘤細胞中常見的免疫抑制分子。

經ELISA方法檢測，B16F10黑素瘤細胞培養上清中IL-10，TGF-β和VEGF水平顯著高于RPMI 1640培養基對照，表明B16F10黑素瘤細胞可分泌這3種免疫抑制因子。收集B16F10黑素瘤細胞培養上清，加入小鼠脾淋巴細胞中，用PHA誘導淋巴細胞活化，并觀察GL-PS對其的影響。與未加GL-PS的對照組相比，GL-PS 0.2～12.8 mg·L-1可使受抑制的淋巴細胞增殖活性顯著增強和受抑制的穿孔素表達增加，GL-PS 3.2和12.8 mg·L-1可使受抑制的顆粒酶B表達增加，GL-PS 0.2～12.8 mg·L-1還可使受抑制的混合淋巴細胞反應顯著增強［62］。GL-PS 0.2～12.8 mg·L-1還可使受抑制的細胞活化分子CD71和FasL表達顯著增加［63］。在小鼠脾單核淋巴細胞培養中，加入B16F10黑素瘤細胞培養上清液，可抑制PHA誘導的小鼠脾淋巴細胞IL-2和IFN-γ和TNF-α mRNA表達和生成，同時加入GL-PS（0.8～12.8 mg·L-1）則可使3種細胞因子的mRNA表達和生成顯著恢復［64］。

RT-PCR檢測結果發現，與未加GL-PS的對照組相比，GL-PS可使B16F10黑素瘤細胞的IL-10mRNA，TGF-β1 mRNA，VEGF mRNA表達顯著減少。ELISA檢測結果還發現，與未加GL-PS的對照組相比，GL-PS可使B16F10黑素瘤細胞的培養上清液中IL-10，TGF-β1和VEGF生成顯著減少［65］。

這些結果表明，GL-PS可在一定程度上拮抗B16F10黑素瘤細胞培養上清誘導的免疫抑制作用，其機制可能與GL-PS促進淋巴細胞活化和抑制B16F10黑素瘤細胞分泌免疫抑制因子有關。

一些研究靈芝抑制腫瘤血管新生的報道，同樣也證實靈芝抑制其他腫瘤細胞表達與分泌VEGF。

我們發現，在低氧條件下培養的人肺癌細胞（PG）可分泌VEGF和GLPP可抑制其分泌［66］。王筱婧等［67］觀察靈芝孢子粉對裸鼠移植性人肝腫瘤生長的影響時，發現在靈芝孢子粉抑制腫瘤生長的同時，VEGF、微血管密度表達水平顯著降低。Hsu等［68］發現，松杉靈芝甲醇提取物（GTME）抑制體外培養的人表皮狀癌A-431細胞增殖，還可增強紫杉醇對A-431細胞增殖的抑制作用。與此同時，抑制EGF受體和VEGF的表達，并抑制人臍靜脈內皮細胞的毛細管形成。EGF可拮抗GTME所致的VEGF表達的抑制。體內給予GTME也能顯著抑制A-431異種移植腫瘤在裸鼠體內生長，并抑制表皮生長因子受體和VEGF的表達。郭鵬榮等［69］觀察靈芝多糖對順鉑抑制荷人膀胱癌T24細胞裸鼠腫瘤生長及血管生成作用的影響。結果發現，靈芝多糖抑制體外培養的T24細胞增殖作用較弱，但與順鉑聯合給藥則有明顯協同作用。靈芝多糖（200 mg·kg-1，灌胃）與順鉑（25 mg·kg-1）聯合，可顯著增強順鉑對荷T24瘤裸鼠腫瘤生長的抑制作用。免疫組化染色結果顯示，靈芝多糖與順鉑聯合可抑制VEGF、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的表達，抑制腫瘤組織的血管生成，且抑制作用顯著強于單用順鉑。qRT-PCR和Western蛋白印跡法檢測結果也顯示，與單用順鉑比較，靈芝多糖聯合順鉑給藥后，荷瘤裸鼠腫瘤組織中VEGF和bFGF的表達顯著下降。結果顯示，靈芝多糖可下調VEGF和bFGF的表達，增強順鉑對T24荷瘤裸鼠腫瘤生長及血管生成的抑制作用。腫瘤細胞分泌的免疫抑制分子對巨噬細胞的抗腫瘤活性亦有抑制作用。靈芝多糖可拮抗或抵消這種抑制作用。Sun等［70］報道，在用脂多糖活化巨噬細胞時，加入B16F10黑素瘤細胞培養上清液可抑制巨噬細胞的活化，再加入不同劑量的GL-PS可拮抗這種抑制作用。與未加GL-PS的對照組相比，GL-PS（0.2～12.8 mg·L-1）可使受抑制的巨噬細胞吞噬活性增強，可使受抑制的NO的生成及TNF-α的生成增加，GL-PS還可增強受抑制的TNF-α殺傷L929細胞的細胞毒活性。

2.4.3 靈芝拮抗肺癌患者血清誘導的淋巴細胞活性抑制

Sun等［71］將不同濃度GL-PS加入受肺癌患者血清抑制的人外周血淋巴細胞，再用PHA誘導活化淋巴細胞，發現與未加GL-PS的對照組比較，GL-PS 3.2和12.8 mg·L-1顯著增強受抑制的淋巴細胞表面細胞活化抗原CD69的表達，顯著改善受抑制的淋巴細胞增殖活性，明顯提高受抑制淋巴細胞穿孔素和顆粒酶B的水平。

2.5 腫瘤相關的靈芝多糖抗體研究

Liao等［72］報道，從靈芝水溶性粗提取物（F3）中，純化出一種富含L-巖藻糖（L-fucose）的多糖組分（FMS），其相對分子質量為35 ku，單糖組成比為L-巖藻糖（Fuc）∶D-木糖（Xyl）∶D-半乳糖（Gal）∶D-甘露糖（Man）=2∶1.5∶2.5∶3.5，尚含有少量葡萄糖（Glu）和氨基糖（葡萄糖胺和半乳糖胺）。注射FMS可顯著抑制小鼠Lewis肺癌（LLC1）生長，并減少腫瘤相關炎癥介質如單核細胞趨化蛋白-1、CXCL1（KC）和粒細胞集落刺激因子的生成，小鼠的B1 B細胞（IgMhiIgDloCD11blo）亞群數增加，提示FMS誘導抗多糖IgM生成。體外實驗表明，注射FMS的小鼠血清對于表達Globo H抗原的LLC1細胞具有抗體介導的細胞毒性。以多糖微陣列分析FMS誘導生成的抗血清結果顯示出高度特異性，其抗原結構位于非還原端，（即Fucα1-2Galβ1-3Gal-NAc-R；其中，Gal，GalNAc和R分別代表D-半乳糖，D-N-乙酰氨基半乳糖和還原末端），是典型的Globo H型以及腫瘤相關的抗原。FMS的組成主要包括1，4-甘露聚糖和1，6-α-半乳聚糖為主鏈，通過Fucα1-2Gal，Fucα1-3/4Man，Fucα1-4Xyl和Fucα1-2Fuc連接，成為FMS誘導產生IgM的分子基礎，FMC的末端Fuc結構對其抗體介導的細胞毒性是十分重要的。這一發現提示，靈芝多糖促進抗Globo H抗體產生的作用對Globo H陽性的肺癌患者具有潛在的免疫治療價值。

2.6 靈芝抗腫瘤作用的免疫學機制與中醫“扶正固本”治則

20世紀70年代，通過藥理和臨床研究，我們建立了探討靈芝“扶正固本”作用機制的工作假說，提出靈芝的扶正固本作用可能與其增強機體重要器官系統的功能，減輕各種致病因素對機體的損害，改善神經-內分泌-免疫系統的調節作用，加強機體的穩態調節能力，維持內環境穩定有關［73］。

中醫理論認為，健康和疾病屬于正邪相爭的不同狀態，健康是由于“正氣存內，邪不可干”；而疾病則是“邪之所湊，其氣必虛”，但治療疾病不一定要徹底消除外邪，只要達到正氣存內，邪不可干即可。靈芝及其有效成分靈芝多糖在體外不能抑制腫瘤細胞增殖，也不能誘導腫瘤細胞凋亡，但在體內卻有明顯的抗腫瘤作用。為探討其作用機制，我們在體內抗腫瘤實驗的基礎上，采用血清藥理學和細胞、分子藥理學相結合的研究方法，發現靈芝之所以在體內有抗腫瘤作用，是因為它能增強機體抗腫瘤免疫功能，包括增強單核巨噬細胞、DC、NK和CTL細胞的功能，促進細胞因子如IFN-γ，TNF-α和IL-2等生成，促進腫瘤相關抗體產生，拮抗腫瘤細胞的免疫逃逸等。此外，一系列研究還證明，靈芝及其有效成分對化療藥和放射線引起的胃腸道、肝、腎、骨髓損傷有明顯的保護作用［1］。通過這些作用，靈芝扶持了正氣，實現了正氣存內，邪（腫瘤）不可干或扶正祛邪（腫瘤）。

研究結果闡明了靈芝“扶正固本”作用的實質是增強機體免疫功能、改善各種致病因素對機體重要器官系統的損害，恢復機體的穩態調節。這一結論與我們的工作假說中對“扶正固本”作用機制的設想是一致的，也為用現代科技方法結合中醫藥傳統理論研究中藥藥理、詮釋中醫理論提供了一個范例［74-75］。

3 靈芝提高腫瘤放化療患者的免疫功能

許多臨床研究均證明，靈芝制劑與化療或放療合用時，對一些腫瘤如胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、大腸癌、前列腺癌和子宮癌等有較好的輔助治療效果。其療效特點如下：提高腫瘤患者對化療和放療的耐受性；減輕化療和放療引起的白細胞減少、食欲缺乏、體質量減輕、抗感染免疫力降低、肝腎損傷等嚴重不良反應；提高腫瘤患者的免疫功能，增強機體的抗腫瘤免疫力；提高腫瘤患者的生活質量，使體質增強［1］。本節僅從在國內外公開發表的20余篇靈芝臨床研究論文中，選擇其中包含免疫指標的臨床研究報道予以介紹。

焉本魁等［76］報道，Ⅱ～Ⅳ期非小細胞肺癌（肺腺癌32例，鱗癌15例，鱗腺癌7例，大細胞癌2例）患者56例，均經胸片和肺CT證實，又經病理組織學或細胞學檢查確診為原發性非小細胞性肺癌患者；不能或不愿手術或術后肺內復發、播散；一般情況好，卡氏（Karnofsky）評分＞60分，預計生存時間＞3個月；具有影像學（X線攝片、CT或MRI）可測的病灶供客觀評價，兩組患者治療前病情無顯著性差異。將56例患者隨機分為治療組（靈芝口服液+化療組）35例，對照組（單用化療）21例?；煈庙樸K加長春地辛方案。治療組同時口服靈芝口服液（靈芝子實體提取物），每次20 mL，一日3次。所統計患者必須完成2個療程治療，未完成治療的或者中途中止或死亡的都判為無效。結果發現，治療2個療程后，治療組35例中完全緩解（CR）為2例（5.7%），部分緩解（PR）為21例（60%），穩定（NC）為9例（25.71%），進展（PD）為3例（8.57%），CR+PR（總緩解率）為23例（65.71%）；對照組21例中CR 為1例（4.76%），PR為8例（38.14%），NC為10例（47.62%），PD為2例（9.52%），CR+PR為9例（42.85%），兩組比較，有顯著性差異（P＜0.01）。治療組卡氏評分增加的為24例（68.57%），穩定的為7例（20%），下降的為4例（11.43%）；對照組評分增加的為9例（42.85%），穩定的為8例（38.10%），下降的為4例（19.05%），治療組生活質量改善率（68.57%）與對照組（42.85%）比較有顯著差異。治療組治療前后的各血像指標無明顯變化，而對照組治療前后紅細胞、白細胞、血紅蛋白和血小板均明顯下降，表明靈芝口服液能減輕化療對骨髓造血功能的抑制。治療后治療組T3，T4和T8較治療前均有不同程度的升高，對照組患者治療后T3，T4和T8各有不同程度的降低，提示靈芝口服液能增強腫瘤患者的細胞免疫功能。

張新等［77］報道，29例主要為經病理診斷為肺癌的Ⅲ～Ⅳ期患者，卡氏評分＞50，預計可存活＞6個月。隨機分組，靈芝組口服靈芝片（每片含靈芝提取物55 mg），每日2次，每次2～4片，連用3個月。對照組以同樣劑量服用安慰劑。觀察靈芝片和安慰劑對肺癌患者免疫調節、血液流變學和臨床治療效果等的影響。結果發現，靈芝組血清TNF-α水平由治療前的（17.7±4.3）ng·L-1增至治療后的（28.7± 6.6）ng·L-1；對照組則分別為14.0±4.9和（19.1± 13.2）ng·L-1。對照組血清可溶性IL-2受體水平從治療前的（259±275）kU·L-1增至治療后的（501± 291）kU·L-1（P＜0.05），而靈芝組僅從（321±311）kU·L-1增至（372±267）kU·L-1（P＞0.05）。服靈芝后未見血液流變學的明顯改變，僅見纖維蛋白原明顯下降。未觀察到肝、腎功能損害等嚴重毒副作用。結果提示，靈芝對肺癌患者有免疫調節和改善血液高凝狀態的作用。

王躍輝等［78］將58例非小細胞肺癌患者隨機分為試驗組和對照組，試驗組29例，在化療同時口服破壁靈芝孢子粉，每次1 g，一日3次；對照組29例，單獨應用化療。兩組化療方案相同：紫杉醇135～175mg·m-2，第1天；順鉑20～25mg·m-2，第1～3天，3周方案，連續4個周期，于化療前后常規給予抗過敏、止吐和保肝輔助治療?；熐凹暗?和4周期化療后進行外周血T細胞亞群（CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+）水平檢測。結果發現，治療后試驗組外周血CD3+，CD4+，CD4+/CD8+水平增高，CD8+水平降低；對照組外周血CD3+，CD4+，CD4+/CD8+水平降低，CD8+水平升高。試驗組CD4+/CD8+比值較治療前及對照組治療后均有顯著升高，差異具有統計學意義。結果提示，破壁靈芝孢子粉可改善非小細胞肺癌化療患者的T細胞亞群，提升患者的細胞免疫功能。

林能俤等［79］將經病理學、細胞學和CT檢查證實的114例癌癥（胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、宮頸癌、結腸癌和膀胱癌）患者隨機分為化療+靈芝組（66例）和單純化療組（48例）進行治療前后對照和組間比較，觀察靈芝提取物配合化療治療癌癥的療效。治療組：從化療（FAM方案）開始及化療后服靈芝提取物膠囊，每次服4粒，每日4次，40 d為1療程。結果可見，靈芝提取物膠囊配合化療可明顯改善癌癥患者的細胞免疫功能。治療前、后化療+靈芝組NK細胞活性分別為51.24±7.90和48.10± 7.90（P＞0.05）；單純化療組分別為51.40±6.62和44.43±7.19（P＜0.05）；化療+靈芝組治療前后CD3，CD4，CD8細胞亞型（%）無顯著改變，但單純化療組治療后CD3，CD4，CD8細胞亞群百分率明顯降低（P＜0.05）?；颊叩闹嗅t臨床癥狀、生活質量亦獲改善。

齊元富等［80］報道，200例住院胃癌、食管癌、肝癌、大腸癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、壺腹周圍癌和胃惡性淋巴瘤腫瘤患者經細胞學或病理學診斷（肝癌為臨床診斷），卡氏生活質量評分均＞60分，本次治療前1個月內未經過抗癌治療。試驗組（100例）口服靈芝孢子粉膠囊（每粒0.25 g），每次4粒，每日3次。對照組（100例）口服貞芪扶正沖劑（每包15 g），每次1包，日3次。兩組病例均服藥4周為1個療程，每例用藥不少于2個療程。兩組患者均在每療程開始當日行常規化療。胃癌、肝癌及大腸癌等用FAM方案，食管癌用CFP方案。4周為1個周期，連續應用2個周期。療程結束后判定療效。結果發現，①近期客觀療效：試驗組總有效率（CR+ PR）43%，其中CR 3例、PR 40例、NC 45例、PD 12例；對照組有效率33%，其中CR 2例、PR 31例、NC 48例、PD 19例。兩組間有顯著差異（P＜0.05）。②生活質量變化：試驗組卡氏評分上升≥10分者66例，上、下波動在10分以內（穩定）者23例，減低＞10分者11例；對照組上升49例，穩定19例，下降32例。兩組比較有顯著性差異（P＜0.05）。③體質量變化：試驗組體質量增加≥1.5 kg者68例，上、下波動在1.5 kg以內（穩定）者21例、降低＞1.5 kg者11例；對照組體質量增加45例，穩定26例，降低29例。兩組比較有顯著性差異（P＜0.05）。④外周血像變化：試驗組治療末白細胞、血小板恢復正常者分別為89和92例，低于正常者11和8例；對照組恢復正常者分別為93和95例，低于正常者分別為7和5例。兩組比較無顯著差異（P＞0.05）。⑤免疫功能變化：治療后與治療前比較，試驗組CD3+細胞從（55.35±7.30）%增至（67.23±6.61）%（P＜0.01），CD4/CD8比值從1.35±0.67增至1.58±0.44（P＜0.05），T淋巴細胞轉化率從（60.19±8.05）%增至（65.02±9.64）%（P＜0.05）；對照組上述免疫指標治療前后均無顯著變化，而試驗組治療后與對照組治療后比較，上述細胞免疫學指標的改善均有顯著性差異（P＜0.05）。試驗組服藥期間未見明顯不良反應。結果表明，靈芝孢子粉膠囊可作為腫瘤化療的輔助治療藥，具有增效、減毒作用。

甄作均等［81］選擇2008年11月至2010年12月該院收治的70例肝癌肝切除患者，采用計算機隨機數字表法將肝癌患者隨機分為常規護肝治療組（常規護肝組）和靈芝孢子粉治療組（靈芝孢子粉組）。另選35例健康體檢者作為健康對照組。常規護肝組術后1 d開始給予復方甘草酸苷注射液+極化液；靈芝孢子粉組在常規護肝治療的基礎上，術后1 d開始口服靈芝孢子粉（每粒0.3 g），每次5粒，一日3次。分別于術前（或入組時）及術后1，7和28 d檢測外周血T淋巴細胞亞群（CD4+和CD8+）和NK細胞。CD4+，CD8+和NK細胞占淋巴細胞百分率的比較采用t檢驗。結果，肝癌患者CD4+細胞百分率（34±7）%較健康對照組（43±7）%明顯降低（P＜0.05）；肝癌患者CD8+細胞百分率（30±3）%較健康對照組（27±3）%明顯升高（P＜0.05）；肝癌患者NK細胞百分率為（13±4）%較健康對照組（19±5）%明顯降低（P＜0.05）。術前常規護肝組肝癌患者的CD4+，CD8+及NK細胞百分率與靈芝孢子粉組比較無顯著差異。與術前相比，兩組肝癌患者術后1 d 的CD4+，CD8+及NK細胞百分率均顯著降低。靈芝孢子粉組術后7和28 d的CD4+細胞百分率與常規護肝組比較明顯升高，CD8+細胞百分率明顯降低，NK細胞百分率明顯升高。結果表明肝癌患者術前及術后早期細胞免疫功能受到抑制，術后早期應用靈芝孢子粉可改善患者的細胞免疫抑制狀態，有利于維護機體的免疫平衡，對患者術后的恢復及預后具有積極意義。

周吉華和張慶華［82］選擇2012年5月-2013年5月于該院行手術治療的90例老年宮頸癌（鱗癌、腺癌、腺鱗癌）患者，采用完全隨機對照研究，隨機數字表法將患者分為對照組和觀察組。兩組患者的年齡、病理學分型、臨床分期等一般資料無統計學差異。對照組術前3周，給予動脈介入新輔助化療，BOMP化療方案：平陽霉素（博萊霉素）16 mg，長春新堿1 mg·m-2，絲裂霉素10 mg·m-2，順鉑50 mg·m-2。導管經單側股動脈插入對側髂內動脈，灌注50%劑量的化療藥物；選擇至子宮動脈，明膠海綿條栓塞至造影處。插管至同側髂內動脈，灌入另50%化療藥物，行子宮動脈栓塞，壓迫包扎。術后平臥8 h，對癥、抗感染。新輔助化療后行宮頸癌根治術，主要為盆髂區淋巴清掃術和廣泛性子宮切除術。觀察組：在對照組治療基礎上，術后給予靈芝孢子粉，即術后第1天起開始口服靈芝孢子粉（每粒0.3 g），每次5粒，1天3次，療程28 d。采用流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞亞群，實時熒光定量PCR法檢測VEGF mRNA。結果顯示，對照組與觀察組治療前外周血T淋巴細胞亞群、NK細胞活性及VEGF mRNA無明顯差異（P＞0.05）；與對照組比較，觀察組治療后CD8+降低，CD4+和CD4+/ CD8+比值和NK細胞活性均顯著升高（P＜0.05），VEGF mRNA表達顯著減少?？梢婌`芝孢子能明顯改善老年宮頸癌患者術后細胞免疫功能，且減少VEGF的表達。

Zhao等［83］將48名進行內分泌治療具有癌相關性疲勞癥狀的乳腺癌患者被隨機分為試驗組和對照組。實驗組患者接受口服靈芝孢子粉每次1 g，一日3次，共治療4周。對照組服用安慰劑治療。在治療前及治療后，患者進行癌癥治療相關疲乏功能評估表（FACIT-F），焦慮及抑郁量表（HADS），生活質量問卷表（EORTC QLQ-C30）的評估。服用靈芝孢子粉前后，檢測患者血液中的TNF-α和IL-6的水平和肝腎功能。應用配對檢驗及回歸分析對結果進行統計學分析。FACT-F評估結果顯示，與對照組相比，患者接受靈芝孢子粉治療后身體狀況評分及疲勞程度評分均明顯升高（分別為P＜0.01 及P＜0.01）。HADS及EORTC QLQ-C30結果顯示，試驗組患者的焦慮及抑郁程度降低及生活質量滿意度增高（分別為P＜0.01和P＜0.01）。試驗組患者用藥前后血液中TNF-α分別為128.7和71.9ng·L-1，IL-6分別為62.4和37.6 ng·L-1，用藥后血液中TNF-α和IL-6均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。表明靈芝孢子粉可改善接受內分泌治療乳腺癌患者的癌相關性疲勞，改善患者的抑郁程度，提高生活質量。其療效機制可能與降低引起癌癥疲勞的免疫因子TNF-α和IL-6水平有關。服用靈芝孢子粉過程中無嚴重不良反應發生。

黃建明等［84］探討了靈芝合劑與抗CD3抗體激活殺傷細胞（anti-CD3 antibody induced activated killer cell，CD3AK細胞）合用對肺癌的臨床療效。CD3AK細胞擴增速度快，細胞毒活性及體內抗腫瘤活性均明顯優于LAK細胞，因而比LAK細胞更適合于腫瘤的過繼免疫治療。26例經病理證實為非小細胞肺癌（鱗癌、腺癌），不愿接受化療、放療的患者。14例接受CD3AK細胞治療（A組）；12例接受CD3AK細胞治療同時服用靈芝合劑（B組）。兩組資料均衡性檢驗，無顯著差異，有可比性。患者在治療前及治療1個月后采用放射免疫分析法測定癌胚抗原。靈芝合劑以靈芝、黃芪、黨參為主組方，每日1劑，水煎服。CD3AK細胞/脂質體IL-2療法：采患者外周血，分離、培養CD3AK細胞，然后回輸給患者。同時肌注脂質體IL-2 10 kU·d-1，30 d為1療程。結果：26例患者經治療后，咳嗽、咯痰、咯血、胸悶等癥狀明顯改善。在接受CD3AK細胞治療的14例患者中，X線顯示的腫塊影像有8例縮小，6例不變。在接受CD3AK細胞治療同時服用靈芝合劑的12例患者中，X線顯示的腫塊影像有7例縮小，5例不變，但兩組患者的“復發”（指肺癌的癥狀如咳嗽、咯痰、咯血、胸悶等加重；X線顯示腫塊影較前增大；血清癌胚抗原、唾液酸、β2微球蛋白等生化指標升高）時間有所不同，A組為（7.82±3.59）月，而B組為（13.26±5.5）月，差異有顯著意義（P＜ 0.01）。兩組治療前后血清癌胚抗原含量均有顯著差異，但兩組間差異無顯著意義。兩組病例的中位生存期以B組較長，為19.38個月，A組較短，為15.28個月。B組的平均生存時間為（23.5±14.39）個月，A組為（15.75±8.30）個月，差異有顯著意義（P＜0.05）?？梢婌`芝合劑與CD3AK細胞合用，可增強CD3AK細胞對肺癌的臨床療效。

4 結語

多年來，學術界重視靈芝的抗腫瘤作用及其機制的研究，除涉及本文提及的免疫學機制外，尚與其抑制腫瘤血管新生［66-68，85-87］，抑制腫瘤細胞移動、黏附［88-92］，抑制腫瘤細胞對抗腫瘤藥的多藥耐藥性［93-96］有關。此外，靈芝醇提取物及其所含三萜類在體外對腫瘤細胞有直接殺傷作用［97-104］。這些實驗結果多是在體外培養的細胞上獲得，尚需在整體動物模型上進一步研究。

靈芝用作腫瘤放化療的輔助治療藥，發揮增效減毒作用，特別是減少放化療的不良反應，已為許多臨床研究初步證實。然而，這僅僅是開始，尚有許多事情要做，特別是進行符合GCP的多中心、大樣本的臨床研究。

與其他中藥的研究相同，靈芝的抗腫瘤藥理研究有兩種思路，一種是從中找出有效成分，最終成為抗腫瘤藥；另一種是中西醫結合研究靈芝輔助治療腫瘤的機制，探討靈芝扶正固本作用的現代內涵，進一步詮釋中醫扶正固本治則。后者是我們多年來走過的道路，并為實踐證明是正確的。

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（本文編輯：齊春會）

Antitumor effect of Ganoderma（Lingzhi）mediated by
immunological mechanism and its clinical application

LIN Zhi-bin
（Department of Pharmacology，School of Basic Medical Sciences，Health Science Center，Peking University，Beijing 100191，China）

The anti-tumor effect of Ganoderma（Lingzhi）is closely related to immunoregulation. Based on our research and other references，this article discussed the antitumor effect of Ganoderma mediated by immunological mechanism，including promoting the function of mononuclear-macrophages，and natural killers，promoting maturation and differentiation of dendritic cells，increasing its antigen presentation，activating lymphocytes and increasing cytotoxicity of cytotoxin T lymphocyte，promoting production of cytokines，inhibiting tumor escape from immune surveillance.Also，clinical studies with immunological indexes were reviewed.

Ganoderma；polysaccharides；tumor；antineoplastic agents，phytogenic；tumor escape；therapeutic uses

LIN Zhi-bin，E-mail：linzb1937@sina.com

R285，R979.1

A

1000-3002（2015）06-0865-18

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.001

林志彬，E-mail：linzb1937@sina.com

（2015-10-29接受日期：2015-11-06）