大黃酚對氨誘導小鼠星形膠質細胞c-fos和c-jun mRNA表達下調的影響及其相關機制

薛占霞，高永山，沈麗霞，薛貴平（河北北方學院.藥學系藥理學教研室，.附屬第一醫院心臟外科，河北張家口 075000）

大黃酚對氨誘導小鼠星形膠質細胞c-fos和c-jun mRNA表達下調的影響及其相關機制

薛占霞1，高永山2，沈麗霞1，薛貴平1
（河北北方學院1.藥學系藥理學教研室，2.附屬第一醫院心臟外科，河北張家口 075000）

目的 探討大黃酚對氨誘導小鼠星形膠質細胞的影響及相關機制。方法 原代小鼠星形膠質細胞共分5組，分別同時加入氯化銨5 mmol·L-1+大黃酚0.1，1.0和10.0 mg·L-1（共3組），氯化銨5 mmol·L-1+細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）抑制劑UO126（10 μmol·L-1）組和氯化銨5 mmol·L-1+p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抑制劑SB239063（10 μmol·L-1）組，處理48 h。紫外分光法測定氧化應激指標丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）的含量以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮合酶（NOS）的活性；Western蛋白印跡法檢測ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平，RT-PCR檢測c-fos和c-jun mRNA的表達。結果 與氯化銨5 mmol·L-1相比，大黃酚1.0和10.0 mg·L-1顯著改善氨誘導的細胞氧化應激，降低了MDA和NO的含量及NOS的活性（P＜0.05），明顯升高了GSH-Px和SOD的活性（P＜0.05）；大黃酚1.0和10.0 mg·L-1也明顯降低氨誘導ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化增加（P＜0.05）；大黃酚0.1，1.0 和10.0 mg·L-1，UO126和SB239063均可逆轉氨誘導c-fos和c-jun mRNA表達下調的作用（P＜0.05）。結論大黃酚通過抗氧化機制影響ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化，進而逆轉氨誘導c-fos和c-jun mRNA表達下調。

大黃酚；星形細胞；氧化性應激；絲裂原活化蛋白激酶

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.006

肝性腦病（hepatic encephalopathy，HE）是急、慢性肝功能衰竭引起的以中樞神經系統功能紊亂為主要臨床表現的一種嚴重綜合征，其病理改變主要表現為星形膠質細胞病變［1］。研究報道，慢性氨處理原代培養小鼠星形膠質細胞，可引起細胞腫脹及對谷氨酸再攝取降低，導致細胞功能障礙［2］，而本課題組先前研究發現，氨5 mmol·L-1處理星形膠質細胞48 h，c-fos和c-jun mRNA表達下調。Fos家族成員可和Jun家族成員形成一組激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）蛋白二聚體［3］。AP-1在細胞增殖、分化、凋亡、胚胎發育、炎癥及其他病理過程中起著重要作用，且學習、記憶及神經發育等均與AP-1蛋白表達有關。AP-1的活性與c-fos和c-jun基因表達密切相關。c-fos和c-jun的表達受多種因素調控［4］，包括第二信使（蛋白激酶C，鈣離子和環磷腺苷等）、興奮性氨基酸（谷氨酸）、某些藥物（乙酰膽堿，阿巴明和人參皂苷等）和有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路［5］。目前研究較多的是MAPK信號通路對c-fos和c-jun基因表達的影響，而MAPK磷酸化是氧化應激的一個重要后續效應［2］。MAPK包括細胞外信號調節激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2），p38 MAPK和JNK1/2/3。研究報道，氨5 mmol·L-1處理星形膠質細胞1，3，6，12，24，48，72 h，ERK1/2的磷酸化在6 h處最高，12～24 h降低，48～72 h回升；p38 MAPK磷酸化在1 h處增加并長時維持此水平；JNK1/2/3磷酸化的峰值在3 h處，此后降低［2］。

研究表明，大黃酚（chrysophanol）對大鼠肝、腦組織過氧化脂質（lipid peroxide，LPO）生成有顯著抑制作用；明顯升高腦中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，清除氧自由基，保護腦神經元細胞膜［5］。但在細胞水平上探討大黃酚的抗氧化作用及對氨誘導小鼠星形膠質細胞的影響尚未見報道。本研究旨在探討大黃酚對氨誘導小鼠星形膠質細胞的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

氯化銨，規格：每瓶100 g，批號：A9434，購于美國Sigma公司；大黃酚（中國藥品生物制品檢定所，批號：110796-201017），制備大黃酚單體〔N，N-二甲基甲酰胺（DMF）∶吐溫80∶生理鹽水=1∶1∶8〕溶液。SOD檢測試劑盒、GSH-Px、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；一抗包括總ERK1/2（批號：sc-94）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2，批號：sc-7383）、總p38 MAPK（批號：sc-166357）和磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK，批號：sc-166182），二抗包括山羊抗兔IgG（批號：sc-45101）和山羊抗鼠IgG（批號：sc-395763）均購自美國Santa Cruz公司。UO126和SB239063均購買于德國Calbiochem公司；Trizol購買于美國Invitrogen公司；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0購自寶生物工程有限公司（中國大連）。PCR擴增儀（Whatman Biometr，德國），低溫超速離心機（北京安亭儀器設備廠，中國）。

1.2 星形膠質細胞的制備［6］及分組

選擇新生1 d內小鼠，取腦，去腦膜，機械分散腦細胞并過濾。用含10%馬血清培養液（g·L-1：DMEM 8.3，葡萄糖1，谷氨酰胺0.292，丙酮酸鈉0.11，碳酸氫鈉3.7，酚紅0.015）稀釋過濾后的細胞，分裝到60 mm培養皿中（每皿裝3 mL培養液），37℃，5%CO2培養。待細胞鋪滿整個培養皿時（＞95%），每皿加入雙丁酰環化腺苷酸0.369 mg。

培養好的原代小鼠星形膠質細胞，隨機分為正常細胞對照組、氯化銨5 mmol·L-1組、氯化銨5 mmol·L-1+大黃酚0.1，1.0和10.0 mg·L-1，氯化銨5 mmol·L-1+UO126 10 μmol·L-1和氯化銨5 mmol·L-1+SB239063 10 μmol·L-1組，處理48 h。

1.3 紫外分光法測定MDA、NO的含量和GSH-Px，SOD及NOS的活性

分別提取正常細胞對照組和實驗組原代星形膠質細胞的總蛋白，BCA法測蛋白濃度。按照說明書分別測定MDA及NO含量（mmol·g-1蛋白）和GSH-Px，SOD及NOS的活性（kU·g-1蛋白）。

1.4 Western蛋白印跡法檢測星形膠質細胞ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化

取制備的各處理組細胞總蛋白，每組50 mg，經10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加1∶1000倍稀釋（ERK1/2，p-ERK1/2，p38 MAPK，p-p38 MAPK）一抗，室溫孵育2 h；TBS-T洗膜4次，每次8 min；加1∶3000倍稀釋的二抗，孵育2 h，TBS-T洗膜4次，每次10 min。使用ECL發光液曝光。采用Window AlphaEase TM FC 32-bit軟件進行條帶吸光度值分析，以磷酸化的ERK1/2及p38 MAPK吸光度和總的ERK1/2 及p38 MAPK吸光度的比值表示ERK1/2及p38 MAPK磷酸化水平的指標。

1.5 RT-PCR檢測原代星形膠質細胞c-fos和c-jun mRNA表達的變化

分別提取正常細胞對照組和氨中毒組原代星形膠質細胞的總RNA，紫外分光光度測定RNA濃度，參考Xue等［7］RT-PCR法測定c-fos和c-jun mRNA的表達，以TATA盒式蛋白編碼基因（TATA-boxing protein，Tbp）為內參。根據試劑盒說明書加入各反應試劑進行逆轉錄及cDNA擴增。逆轉錄反應程序：30℃ 10 min，50℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃5 min；PCR擴增程序：94℃預變性2 min，94℃變性40 s，60℃（c-fos）、57℃（c-jun）、55℃（Tbp）復性40 s，72℃延伸40 s，循環37次，72℃延伸加時10 min。反應結束后瓊脂糖凝膠電泳，Fluorochem 5500成像系統采集圖像，以c-fos和c-jun mRNA吸光度和Tbp吸光度的比值表示c-fos和c-jun mRNA相對表達量。

c-fos，c-jun和 Tbp的引物如下：c-fos （forward：5′-ACCTAGCCGTGGAGCTTGG-3′，reverse：5′-GCCCTTGGTTGTTTACCTGG-3′，542 bp）［8］；c-jun（forward：5′-CCTTCTACGACGATGCCCTCAA-3′，reverse：5′-GGGGTCGGTGTAGTGGTGATGT-3′，228 bp）［9］；Tbp（forward：5′-CCACGGACAACTGCGTTGAT-3′；reverse：5′-GGCTCATAGCTACTGAACTG-3′，236 bp）［10］。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 大黃酚對氨誘導小鼠星形膠質細胞MDA和NO的含量及NOS，GSH-Px及SOD活性的影響

表1結果顯示，與正常細胞對照組比較，氯化銨5 mmol·L-1組星形膠質細胞MDA和NO的含量及NOS活性升高（P＜0.05），同時GSH-Px和SOD活性降低（P＜0.05），說明高濃度氨導致細胞發生氧化應激；與氯化銨5 mmol·L-1組相比，大黃酚0.1 mg·L-1組，氧化應激各指標無明顯變化；大黃酚1.0和10.0 mg·L-1組MDA、NO含量及NOS活性顯著降低（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性明顯升高（P＜0.05），提示在細胞水平，大黃酚具有抗氧化作用。

Tab.1 Effect of chrysophanol on oxidative stress indicators in mouse astrocytes exposed to NH4Cl

2.2 大黃酚降低氨誘導小鼠星形膠質細胞ERK1/2 和p38 MAPK的磷酸化

圖1結果顯示，與正常細胞對照組比較，氯化銨5 mmol·L-1組ERK1，ERK2和p38 MAPK的磷酸化水平分別增加了143%，147%和139%（P＜0.05）；與氯化銨5mmol·L-1組比較，大黃酚1.0和10.0mg·L-1實驗組ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），大黃酚0.1 mg·L-1組不能逆轉氯化銨誘導ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平升高。

2.3 大黃酚，UO126和SB239063逆轉氨誘導小鼠星形膠質細胞c-fos和c-jun mRNA的表達水平

圖2結果顯示，與正常細胞對照組比較，氯化銨5 mmol·L-1組，c-fos和c-jun mRNA表達分別顯著下調了84%和68%（P＜0.05）；與氯化銨5 mmol·L-1組比較，大黃酚0.1，1.0，10 mg·L-1，UO126和SB239063組c-fos mRNA表達分別上調了69%，81%，80%，80%和70%（P＜0.05），c-jun mRNA表達分別上調了50%，66%，64%，67%和50%（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of chrysophanol on ERK1/2（B，C）and p38 MAPK（D）phosphorylation in mouse astrocytes exposed to NH4Cl by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.1：normal cell control；2：NH4Cl 5 mmol·L-1；3-5：NH4Cl 5 mmol·L-1+chrysophanol 0.1，1.0 or 10 mg·L-1.B，C and D were the semiquantitative results of A.±s，n=5.*P＜0.05，compared with normal cell control group；#P＜0.05，compared with NH4Cl group.

Fig.2 Effect of chrysophanol，UO126 and SB239063 on c-fos（B）and c-jun（C）mRNA expression in mouse astrocytes exposed to NH4Cl by RT-PCR.See Tab.1 for the cell treatment.1：normal cell control；2：NH4Cl 5 mmol·L-1；3-5：NH4Cl 5 mmol·L-1+chrysophanol 0.1，1.0 or 10 mg·L-1；6：NH4Cl 5 mmol·L-1+UO126 10 mmol·L-1；7：NH4Cl 5 mmol·L-1+ SB239063 10 mmol·L-1.B，C were the semiquantitative results of A.±s，n=5.*P＜0.05，compared with normal cell control group；#P＜0.05，compared with NH4Cl group.

3 討論

本研究發現，大黃酚可消除氨誘導小鼠星形膠質細胞氧化應激，并進一步抑制ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平的升高，從而逆轉氨誘導c-fos和c-jun mRNA表達下調的作用。提示大黃酚可通過抗氧化應激的機制影響并保護星形膠質細胞的功能。但大黃酚作為大分子量有機物，不易通過細胞膜，推測大黃酚主要通過抑制擴散到細胞外的超氧自由基而起到抗氧化作用。

研究報道，c-fos和c-jun基因表達與MAPK磷酸化水平呈正相關［11］。但本課題研究發現，慢性高濃度氨處理星形膠質細胞，ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平升高，但c-fos和c-jun mRNA表達下調，提示c-fos和c-jun mRNA表達亦受其他因素調控。據文獻報道，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體激動劑可誘導紋狀體c-fos基因表達［3］。急性或慢性氨中毒均可影響NMDA受體的表達。在急性大劑量氨中毒大鼠模型的大腦皮質、海馬、小腦等區域，NMDA受體被活化［12］，但大鼠慢性氨中毒，海馬區NMDA受體功能下降［13］。結合本課題現有研究結果推測星形膠質細胞慢性氨中毒，NMDA受體功能下降，導致c-fos和c-jun mRNA表達下調，且NMDA受體功能的改變可能受MAPK信號通路調控。因此大黃酚逆轉氨誘導c-fos和c-jun mRNA表達下調的機制還有待進一步研究。

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（來稿日期：2015-05-21接受日期：2015-11-17）

（本文編輯：賀云霞）

Effect of chrysophanol on down-regulated expression of c-fos and c-jun mRNA in mouse astrocytesexposed to ammonia and related mechanisms

XUE Zhan-xia1，GAO Yong-shan2，SHEN Li-xia1，XUE Gui-ping1
（1.Department of Pharmacology，2.The First Affiliated Hospital Cardiac Surgery，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）

OBJECTlVE To investigate the effect and mechanisms of chrysophanol on the expression of c-fos and c-jun mRNA induced by ammonia chloride（NH4Cl）in mouse astrocytes.METHODS Primary mouse astrocytes were cultured with NH4Cl 5 mmol·L-1+chrysophanol 0.1，1.0 or 10.0 mg·L-1，or NH4Cl 5 mmol·L-1+extracellular regulated kinase1/2（ERK1/2）inhibitor UO126 10 mmol·L-1and NH4Cl 5 mmol·L-1+p38 mitogen-activated protein kinase（p38 MAPK）inhibitor SB239063 10 mmol·L-1for 48 h. The levels of glutathione peroxidase（GSH-Px），superoxide dismutase（SOD），malondaldehyde（MDA），nitric oxide（NO）and nitric oxide synthase（NOS）were detected by UV spectrophotometry.The phosphorylation levels of ERK1/2 and p38 MAPK were detected by Western blotting.The expression of c-fos and c-jun mRNA was detected by RT-PCR.RESULTS Compared with NH4Cl 5 mmol·L-1group，ammonia-induced astrocytes oxidative stress was improved by chrysophanol（1.0 and 10.0 mg·L-1）. The content of MDA and NO and the activity of NOS were reduced（P＜0.05）.The activity GSH-Px and SOD was increased（P＜0.05）.The phosphorylation level of ERK1/2and p38 MAPK induced by ammonia was reduced in chrysophanol groups（P＜0.05）.Ammonia-induced c-fos and c-jun mRNA expression downregulation was reversed by chrysophanol（0.1，1.0 and 10.0 mg·L-1）and UO126 and SB239063（P＜0.05）.CONCLUSlON Chrysophanol may improve the downregulated expresion of c-fos and c-jun mRNA in mouse astrocytes exposed to NH4Cl by anti-oxidative stress by inhibiting the ERK1/2 and p38 MAPK phosphorylation.

chrysophanol；astrocyte；oxidative stress；MAP kinase

The project supported by Outstanding Youth Fund of Bureau of Education in Hebei Province （Y2012002）；and Natural Science Foundation of Hebei Province（H2012405016）

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A

1000-3002（2015）06-0912-05

河北省教育廳優秀青年基金資助項目（Y2012002）；河北省自然基金資助項目（H2012405016）

薛占霞，女，講師，醫學博士，主要從事神經藥理學研究，E-mail：xuezhanxia412@163.com，Tel：18931311063

沈麗霞，E-mail：shenlixiacn@sina.com，Tel：13932328109