補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體的酶促動力學(xué)

陽海鷹，鐘玉環(huán)，陳　琳，李　樺，莊笑梅（抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體的酶促動力學(xué)

陽海鷹，鐘玉環(huán)，陳琳，李樺，莊笑梅
（抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

目的 研究中藥有效成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的細(xì)胞色素P450（CYP）酶促動力學(xué)特征，比較其結(jié)構(gòu)和種屬差異，為體內(nèi)藥代動力學(xué)特征的預(yù)測提供科學(xué)依據(jù)。方法 建立補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測方法，在優(yōu)化人和大鼠肝微粒體孵育體系和評價體外代謝穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了代謝穩(wěn)定性和酶促動力學(xué)研究，應(yīng)用非線性回歸法計算最大反應(yīng)速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）。結(jié)果 應(yīng)用建立的LC-MS/MS檢測方法，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在肝微粒體孵育液中定量范圍為0.1～50.0 μmol·L-1，線性關(guān)系良好，精密度和準(zhǔn)確度等滿足檢測要求。體外代謝穩(wěn)定性研究顯示，當(dāng)?shù)孜餄舛葹? μmol·L-1，蛋白濃度為0.5 g·L-1，孵育40 min內(nèi)，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體呈線性消除，體外半衰期分別為74.5，95.0，74.5和173.3 min。補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體中的Vmax分別為：（1.140± 0.080）μmol·min-1·g-1蛋白，（0.620±0.060）μmol·min-1·g-1蛋白；Km分別為（12.9±0.3）μmol·L-1和（7.4±1.3）μmol·L-1。異補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體中的Vmax分別為（0.251±0.012）μmol·min-1·g-1蛋白和（0.103± 0.014）μmol·min-1·g-1蛋白；Km分別為：（3.0±0.4）μmol·L-1和（3.4±0.7）μmol·L-1。結(jié)論 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的CYP酶促動力學(xué)特征及代謝穩(wěn)定性具有一定的種屬和結(jié)構(gòu)差異，在大鼠兩者基于CYP酶的代謝清除過程可能相似。而在人體，異補(bǔ)骨脂素的CYP代謝清除可能慢于補(bǔ)骨脂素，導(dǎo)致藥代動力學(xué)特征的差異。

補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；肝微粒體；細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)；藥代動力學(xué)

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.008

中藥補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）的果實，性溫，味辛，具補(bǔ)腎助陽之功效。補(bǔ)骨脂素（psoralen，PRN）和異補(bǔ)骨脂素（isopsoralen，IPRN）是補(bǔ)骨脂的主要有效成分，具有抗腫瘤、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗過敏等功效［1］。PRN 和IPRN還是多種中藥制劑中的重要組成成分，主要的臨床應(yīng)用是治療白癜風(fēng)、銀屑病等皮膚頑疾。口服PRN加紫外線照射的光化學(xué)療法自1974年首次報告有效治療銀屑病以來，已治愈大量患者，1982年美國FDA批準(zhǔn)臨床應(yīng)用該法治療銀屑病［2］。

PRN和IPRN屬于呋喃香豆素類化合物，其代謝主要包括7-羥化、內(nèi)酯環(huán)開環(huán)等途徑［3］。文獻(xiàn)報道，這類化合物在體內(nèi)主要經(jīng)細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P-450，CYP）代謝并對CYP酶有抑制或誘導(dǎo)作用，應(yīng)用人肝微粒體和大鼠肝微粒體研究發(fā)現(xiàn)，PRN和IPRN對CYP1A2有較強(qiáng)的抑制作用［4］。因此，研究PRN和IPRN的代謝特征以及與CYP代謝酶的作用，對加深該有效成分藥理藥效本質(zhì)及作用機(jī)制的認(rèn)識、指導(dǎo)臨床合理用藥有重要意義。本研究應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分別研究PRN和IPRN在人源和大鼠肝微粒體的CYP酶促動力學(xué)特征，比較結(jié)構(gòu)和種屬差異的影響，為深入研究PRN和IPRN與CYP酶的相互作用以及體內(nèi)藥代動力學(xué)特征預(yù)測提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

對照品PRN（純度99.9%，批號110739-201416）、IPRN（純度 99.9%，批號 102983-201423）（結(jié)構(gòu)見圖1）和內(nèi)標(biāo)鹽酸普萘洛爾（純度＞99%，批號BCBB9359V）購自中國藥品和生物制品檢定所；NADPH購自瑞士Roche公司；甲醇和乙腈均為色譜純，購自美國Sigma公司；水為娃哈哈飲用純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其他試劑均為分析純。Agilent 6410 B液質(zhì)聯(lián)用儀和ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）為美國Agilent公司產(chǎn)品。

Fig.1 Chemical structures of psoralen（PRN）（A）and isopsoralen（lPRN）（B）.

1.2 實驗動物

SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量為180～220 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，動物合格證號：SYXK-（軍）2011-0010。

1.3 肝微粒體來源或制備

50人混合肝微粒體（蛋白含量20 g·L-1，批號：34689）購自美國BD Gentest公司。20只雄性SD大鼠混合肝微粒體為實驗室自制（差速離心法）［5］，應(yīng)用BCA蛋白檢測方法測得蛋白含量10 g·L-1。

1.4 LC-MS/MS定量檢測PRN和lPRN

色譜條件：流動相A為含有0.1%甲酸的甲酸銨5 mmol·L-1溶液，B為含有0.1%甲酸的乙腈。洗脫梯度程序為0.0～1.0 min（30%B），1.0～1.5 min （30%B～95%B），1.5～3.5 min（95%B），3.5～4.0 min （95%B～30%B），平衡時間為4.0～4.5 min（30%B），運(yùn)行時間為4.5 min，流速為0.3 mL·min-1，柱溫25℃。內(nèi)標(biāo)為鹽酸普奈洛爾100 μg·L-1。

質(zhì)譜條件：ESI源正離子MRM方式檢測，毛細(xì)管溫度300℃，毛細(xì)管電壓4000 V，PRN和IPRN的檢測離子對質(zhì)荷比為186.7→131.1，碰撞能量為22 V，內(nèi)標(biāo)的檢測離子對質(zhì)荷比為260→116.2，碰撞能量為14 V，PRN和IPRN的MS2質(zhì)譜圖見圖2。

1.5 PRN和lPRN的肝微粒體溫孵和代謝穩(wěn)定性

肝微粒體體外溫孵條件依照本研究室既往報道方法［6］。用磷酸鹽緩沖液100 mmol·L-1（K2HPO40.5 mmol·L-1/KH2PO40.5 mmol·L-1，pH=7.4）配置不同濃度的PRN和IPRN溶液（0.5，1.0和5.0 μmol·L-1），加入不同蛋白濃度肝微粒體溶液（0.2，0.5和1.0 g·L-1），與NADPH輔酶液（終濃度1 mmol·L-1）于37℃ 同時預(yù)孵育5 min后，將NADPH輔酶液加入含藥的肝微粒體溶液中啟動反應(yīng)，繼續(xù)孵育一定時間（5，10，20，30，40和60 min）后，將終體積為200 μL的孵育樣品移至冰上，加入400 μL含內(nèi)標(biāo)（100 μg·L-1）的甲醇-乙腈（1∶1）終止反應(yīng)，渦旋30 s，離心（13 800×g，4℃）10 min，取上清10 μL進(jìn)樣分析。考察不同孵育時間、肝微粒體蛋白濃度和底物濃度對PRN和IPRN代謝穩(wěn)定性的影響，參考有關(guān)原則優(yōu)化溫孵條件［6］。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇0.5 g·L-1的肝微粒體蛋白含量，1 μmol·L-1的PRN和IPRN，37℃溫孵不同時間（0，5，10，20，40和60 min），計算代謝穩(wěn)定性。

Fig.2 Mass spectra of PRN（A）and lPRN（B）.

1.6 PRN和lPRN在大鼠和人肝微粒體的酶促動力學(xué)特征

根據(jù)代謝穩(wěn)定性實驗結(jié)果，系列濃度PRN （0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，20.0和50.0 μmol·L-1）和 IPRN（0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，20.0和50.0 μmol·L-1）分別在0.5 g·L-1大鼠肝微粒體中孵育20 min，相同系列濃度的PRN在0.5 g·L-1的人肝微粒體中孵育20 min、IPRN在0.5 g·L-1的人肝微粒體中孵育40 min后，將終體積為200 μL的孵育樣品移至冰上，并加入400 μL含內(nèi)標(biāo)的甲醇-乙腈（1∶1）終止反應(yīng)，渦旋，離心（13 800×g，4℃）10 min，取上清10 μL進(jìn)樣分析，測定PRN和IPRN的含量，計算代謝速率變化，每個濃度3個平行樣品。

用滅活后的空白人或大鼠肝微粒體溶液（0.5 g·L-1）配制0.1，0.5，2.0，10.0，20.0和50.0 μmol·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各200 μL，加入400 μL含內(nèi)標(biāo)（100 μg·L-1）的甲醇-乙腈（1∶1），渦旋30 s，離心（13 800×g，4℃）10 min，取上清10 μL進(jìn)樣分析，測定PRN和IPRN的含量。質(zhì)控樣品濃度分別為0.2，5.0和40.0 μmol·L-1，用與系列標(biāo)準(zhǔn)溶液相同方法處理，連續(xù)3 d，每日測定各濃度的3個平行樣品，得到日內(nèi)和日間精密度。為了考察回收率和基質(zhì)效應(yīng)，配制含0.2，5.0和40.0 μmol·L-13個濃度的人或大鼠肝微粒體溶液樣品，用與系列標(biāo)準(zhǔn)溶液相同方法處理為樣品Ⅰ；將空白樣品同樣方法處理后再加標(biāo)準(zhǔn)溶液，為樣品Ⅱ；另取標(biāo)準(zhǔn)溶液，為樣品Ⅲ。以同濃度樣品I的峰面積與樣品Ⅱ的峰面積之比，計算回收率；以同濃度樣品Ⅱ的峰面積與樣品Ⅲ的峰面積之比，計算基質(zhì)效應(yīng)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

體外代謝穩(wěn)定性：以0時的PRN和IPRN濃度作為100%，其他時間點的濃度與0時的濃度相比得到其剩余百分比。將各時間點剩余百分比的自然對數(shù)與相應(yīng)的孵育時間作圖，經(jīng)直線回歸求得斜率（-k），由式（1）得到兩藥在人和大鼠肝微粒體中的體外代謝半衰期（t1/2）。

酶促動力學(xué)參數(shù)計算：應(yīng)用GraphPad Prism version 5.0（GraphPad Software Inc.，La Jolla， CA，USA）軟件中的非線性回歸分析方法計算PRN和IPRN在大鼠和人肝微粒體酶中代謝降解的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax），內(nèi)在清除率Clint=Vmax/Km，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)均用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 PRN和lPRN定量檢測方法確證

如圖3所示，PRN、IPRN和內(nèi)標(biāo)對照品色譜峰在大鼠肝微粒體孵育液中的保留時間分別為0.93，0.92和0.76 min，在分析物出峰區(qū)域，未見內(nèi)源性物質(zhì)干擾。在0.1～50.0 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，PRN 和IPRN的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y=0.1127x+0.0235（r2=0.990）和y=0.0867x+0.0045 （r2=0.995）。0.2，5.0和40.0 μmol·L-1質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間精密度在3.8%和10.9%以內(nèi)。PRN和IPRN的準(zhǔn)確度在92%～113%和101%～109%之間，回收率分別為98%～110%和95%～117%，基質(zhì)效應(yīng)在為98%～114%和90%～110%之間，均滿足檢測要求。

Fig.3 MRM chromatograms of PRN（C），lPRN（D）and internal standard（lS）in rat liver microsomal（RLM）incubations.A，B：blank RLM.1：propranolol hydrochloride（IS）；2：PRN；3：IPRN.The analysis of PRN，IPRN and IS was performed on an Agilent 6410 B LC-MS/MS，with a ZORBAX SB-C18column（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）.The mobile phase was water （containing 5 mmol·L-1ammonium formate and 0.1%formic acid）and acetonitrile（containing 0.1%formic acid）running with the gradient elution.The flow rate was 0.3 mL·min-1.The transition ions m/z 186.7→131.1 and m/z 260→116.2 were selected for the quantification of PRN，IPRN and IS，respectively.

應(yīng)用人肝微粒體孵育液進(jìn)行部分驗證的結(jié)果表明，PRN和IPRN在人肝微粒體中孵育液的基質(zhì)效應(yīng)與大鼠微粒體孵育液相似，在97%～116%和91.7%～102%之間，線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度均符合檢測要求。

2.2 PRN和lPRN在大鼠和人肝微粒體中代謝穩(wěn)定性

將不同濃度的PRN和IPRN與不同蛋白濃度的肝微粒體溫孵不同時間后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜餄舛仍? μmol·L-1以內(nèi)、蛋白含量0.5 g·L-1，以及孵育時間在40 min內(nèi)，兩藥呈線性消除。兩者的體外肝微粒體代謝穩(wěn)定性結(jié)果見圖4。由公式（1）計算得到PRN在大鼠和人肝微粒體的t1/2分別為74.5和95.0 min，IPRN的t1/2分別為74.5和173.3 min。由體外代謝穩(wěn)定性的時間動力學(xué)曲線可見，PRN在大鼠和人肝微粒體中孵育20 min時，原型藥物代謝消除約20%。IPRN在大鼠肝微粒體中孵育20 min、人肝微粒體中孵育40 min后，原型藥物的代謝消除約為20%，以此確定酶動力學(xué)研究的孵育時間。

Fig.4 In vitro percentage of substrate remainingtime curves of PRN and lPRN in human or rat liver microsomes（HLM or RLM）.1 μmol·L-1PRN and IPRN solutions were mixed with liver microsomes at the protein content of 0.5 g·L-1.The mixtures were added with NADPH 1 mmol·L-1after being pre-warmed at 37°C for 5 min to reach the final volume of 200 μL.After 5，10，20，30，40 and 60 min incubation at 37°C，the reactions were stopped by addition of 400 μL methanolacetonitrile（1∶1）containing 100 μg·L-1IS.After vortexing for 30 s，the sample was centrifuged at 13 800×g for 10 min （4℃）.A 10 μL aliquot of the supernatant was analyzed by LC-MS/MS.±s，n=3.

2.3 PRN和lPRN在大鼠和人肝微粒體中酶促動力學(xué)比較

應(yīng)用Eadie-Hofstee作圖法處理數(shù)據(jù)可見，4組酶促動力學(xué)都未顯示明顯的雙相動力學(xué)特征，初步判斷主要是單酶介導(dǎo)的肝代謝。應(yīng)用非線性回歸分析方法擬合PRN和IPRN在人和大鼠肝微粒體中酶促動力學(xué)曲線見圖5，參數(shù)見表1。從結(jié)果可見，PRN對大鼠和人肝CYP酶的Km和Vmax均有明顯的種屬差異，但是Clint沒有明顯差異。IPRN對大鼠和人肝CYP酶的Km相似，Vmax有明顯的差異，因而Clint也表現(xiàn)出明顯差異；比較實驗結(jié)果可見，IPRN在人肝微粒體的Clint明顯低于其他3組，PRN在大鼠和人肝微粒體以及IPRN在大鼠肝微粒體中的Clint相似。

Fig.5 Reaction rate-substrate concentration curves of PRN（A，B）and lPRN（C，D）in HLM（B，D）or RLM（A，C）. See Fig.4 for the incubation system and procedure.PRN（0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，20.0 and 50.0 μmol·L-1）and IPRN（0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，20.0 and 50.0 μmol·L-1），were incubated with RLM or HLM for 20 min，IPRN with HLM for 40 min.RLM and HLM were at the protein content of 0.5 g·L-1.±s，n=3.

Tab.1 Enzymatic kinetics parameters of PRN and lPRN in HLM or RLM

3 討論

藥物的CYP酶促動力學(xué)特征是決定藥物代謝性質(zhì)的重要參數(shù)，也是評價藥物相互作用潛能的基礎(chǔ)［7］。早在30年前，美國制藥工業(yè)界就試圖根據(jù)藥物在肝微粒體中的酶促動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行體內(nèi)代謝動力學(xué)的預(yù)測［8］。由于酶促動力學(xué)研究方法比較成熟，并可應(yīng)用人源材料（人肝微粒體）通過體外實驗獲得酶動力學(xué)參數(shù)（Km和Vmax），因此可快速在人體試驗前用最低成本獲得肝清除率等重要性質(zhì)，對新藥研發(fā)具有重要意義［9］。

本研究首先進(jìn)行了體外代謝穩(wěn)定性評價，了解兩藥的體外肝代謝消除性質(zhì)，并優(yōu)化肝微粒體蛋白濃度、底物濃度和孵育時間等孵育條件。比較兩藥的大鼠和人肝微粒體的代謝穩(wěn)定性曲線可見，PRN 和IPRN在大鼠微粒體以及PRN在人肝微粒體的消除曲線相似，而IPRN在人肝微粒體的消除曲線較為平緩，明顯慢于前3組，此結(jié)果與酶促動力學(xué)研究中獲得的體外清除率相符。

酶促動力學(xué)研究主要有兩種方法，底物消除法和產(chǎn)物生成法，雖然產(chǎn)物生成法是比較準(zhǔn)確測定酶促動力學(xué)參數(shù)的方法，但必須獲得藥物代謝轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)以及產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品。相比之下，底物消除法更適用于化合物研究的早期。Youdim等［10］研究發(fā)現(xiàn)，兩種方法獲得的結(jié)果除了個別藥物代謝通路復(fù)雜，會產(chǎn)生3倍的偏差外，其他大部分化合物的Km值都不會有太大的差異。因此，本研究在缺乏代謝產(chǎn)物鑒定和標(biāo)準(zhǔn)品的基礎(chǔ)上采用了原型藥物消除法進(jìn)行酶促動力學(xué)研究。

在酶促動力學(xué)研究中獲得的Km和Vmax參數(shù)值，除了定義藥物的酶促反應(yīng)性質(zhì)外，還可為藥物體內(nèi)藥代動力學(xué)特征的預(yù)測提供重要信息。例如，當(dāng)體內(nèi)藥物濃度遠(yuǎn)低于Km時，代謝清除通常是線性的，此時清除率Cl約為Vmax/Km；當(dāng)體內(nèi)藥物濃度高于Km時，藥物的體內(nèi)清除將逐漸超過酶的代謝能力，呈現(xiàn)非線性過程。由本研究的數(shù)據(jù)可見，PRN和IPRN在人肝微粒體中的Km分別為7.4和3.4μmol·L-1，口服含有這兩種成分的中藥后，吸收入血的濃度很可能低于該水平，藥物將以線性速率消除。但是，當(dāng)多種藥物合并使用，PRN和IPRN的代謝受到抑制時，血藥濃度可能大幅增加，應(yīng)注意可能出現(xiàn)的非線性藥代動力學(xué)過程。此外，根據(jù)體外內(nèi)在清除率推算肝清除率，可初步判斷肝代謝清除作用對藥物體內(nèi)總清除及生物利用度的貢獻(xiàn)。從本研究中獲得的內(nèi)在清除率推算其相應(yīng)的肝清除率，并與大鼠和人的生理肝血流量（Qhrat=55.2 mL·min-1·kg-1，Qhhuman=20.7 mL·min-1·kg-1）［11］相比后發(fā)現(xiàn)，PRN和IPRN在人肝的抽提率分別約為80%和60%；而兩者在大鼠肝的抽提率相似約為60%，兩者的生物利用度均可能＜40%。

代謝酶存在的種屬差異，是動物結(jié)果難以直接外推到人的主要因素［12］。本研究系統(tǒng)比較了兩個化合物在大鼠和人肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性及酶促動力學(xué)特征。結(jié)果顯示，PRN在人肝微粒體CYP酶的Km顯著高于大鼠，Vmax低于大鼠，而線性清除率在兩個種屬間相似。IPRN與人和大鼠肝CYP酶的Km相當(dāng)，但Vmax有明顯差別，因此Clint也有明顯差別，在人肝微粒體中Clint顯著低于大鼠。結(jié)果分析表明，兩個化合物在人和大鼠肝微粒體的酶促動力學(xué)性質(zhì)存在種屬差異，在應(yīng)用動物體外結(jié)果進(jìn)行人體外推時，需要注意。

PRN和IPRN是同分異構(gòu)體，在結(jié)構(gòu)上分別屬于線性和角型兩類天然呋喃香豆素化合物［13］。由目前研究可見，兩者在人和大鼠肝微粒體中，酶促動力學(xué)特征均有差別，特別是在人肝微粒體，PRN的代謝清除要明顯快于IPRN，提示二者在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的差異，可能導(dǎo)致其與酶的活性位點結(jié)合特性和親和力的差異，有必要在動物和人體代謝研究中進(jìn)一步證實。

綜上所述，PRN和IPRN在體外大鼠和人肝微粒體孵育體系中的代謝清除呈現(xiàn)明顯的種屬和結(jié)構(gòu)差異。這些結(jié)果為深入研究PRN和IPRN與CYP酶的相互作用，以及應(yīng)用體外結(jié)果對體內(nèi)藥代動力學(xué)特征的預(yù)測和解釋提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

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（本文編輯：沈海南 齊春會）

Enzyme kinetics of psoralen and isopsoralen in rat and human liver microsomes

YANG Hai-ying，ZHONG Yu-huan，CHEN Lin，LI Hua，ZHUANG Xiao-mei
（State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTlVE To investigate and compare the enzyme kinetic characters of psoralen （PRN）and isopsoralen（IPRN）in rat and human liver microsomes.METHODS PRN and IPRN in liver microsomes incubates were determined using LC-MS/MS.The enzyme kinetic and metabolic stability ofPRN and IPRN were investigated by employing the optimized rat and human liver microsomes incubations. The Vmaxand Kmvalues were calculated using the nonlinear regression method.RESULTS The quantitative method showed good linearity within the range of 0.1-50.0 μmol·L-1and was suitable for the assay in biological samples.The in vitro elimination was linear with the substrate concentrations lower than 1 μmol，the protein concentration within 0.5 g·L-1，and the incubation time within 40 min.The t1/2values of PRN and IPRN in rat and human liver microsomes were 74.5，95.0，74.5 and 173.3 min，respectively.The Vmaxvalues of PRN in rat and human liver microsomes were（1.140±0.080）μmol·min-1·g-1protein，（0.620±0.060）μmol·min-1·g-1protein，while Kmvalues of PRN in rat and human liver microsomes were（12.9±0.3）μmol·L-1，（7.4±1.3）μmol·L-1，respectively.The Vmaxvalues of IPRN in rat and human liver microsomes were（0.251±0.012）and（0.103±0.014）μmol·min-1·g-1protein，while Kmvalues of IPRN in rat and human liver microsomes were（3.0±0.4）μmol·L-1，（3.4±0.7）μmol·L-1，respectively. CONCLUSlON The enzyme kinetic characters and metabolic stability of PRN and IPRN show species and chemical structures related differences.Interestingly，the metabolic eliminations of PRN and IPRN are similar in rats.However，the metabolic elimination of IPRN in humans involved in CYP enzymes may be much slower than that of PRN.

psoralen；isopsoralen；liver microsomes；cytochrome P-450 enzyme system；pharmacokinetics

The project supported by National Science and Technology Major Project（2012ZX09301003-001-009）；National Science and Technology Major Project（2013ZX09J13103-01B）；National Science and Technology Major Project（2014ZX09507001003）；and National Science and Technology Major Project（2014ZX09J14103-01A）

ZHUANG Xiao-mei，E-mail：xiaomeizhuang@163.com，Tel：（010）66930665

R969.1，R285.5

A

1000-3002（2015）06-0924-07

國家科技重大專項（2012ZX09301003-001-009）；國家科技重大專項（2013ZX09J13103-01B）；國家科技重大專項（2014ZX09507001003）；國家科技重大專項（2014ZX09J14103-01A）

陽海鷹，女，碩士，高級實驗師，主要從事藥物代謝研究。

莊笑梅，E-mail：xiaomeizhuang@163.com，Tel：（010）66930665

（2015-03-24接受日期：2015-11-09）