咳喘顆粒HP L C指紋圖譜研究

劉德賢 陶遵威 張 婷 張 巖

1.天津中醫藥大學，天津 300073；2.天津醫藥科學研究所，天津 300020

咳喘顆粒為院內制劑，由五味子、白芍、甘草、黃芩等14味中藥組成，具有解表散寒、溫肺化飲之功效，治療咳嗽、哮喘效果顯著，未見相關的指紋圖譜報道。中藥復方作用特點相輔相成，即多成分、多系統、多靶點的綜合效應[1-3]，因此用單一指標成分往往不能達到全面評價和控制復方制劑質量的效果，而指紋圖譜由于其具有多指標全面分析的作用[4-5]，已成為評價中藥質量的有效方法，并被廣泛用于中藥及其復方制劑的質量控制研究[6-10]。因此，為了更好地控制咳喘顆粒質量，為臨床用藥提供依據，本實驗采用HPLC方法[11-12]建立咳喘顆粒的化學指紋圖譜，著重表達藥材的信息。對咳喘顆粒指紋圖譜中主要指紋峰進行歸屬，實現系統、多角度控制咳喘顆粒質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（LC-20AT日本島津公司），PDA檢測器；超聲儀（KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（ABS135-S，瑞士梅特勒-托利多公司）；電子天平（JJ200，常熟雙杰測試儀器廠 ）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號：1110736-200934，由中國食品藥品檢定研究院提供）、甘草苷對照品（批號：11610-201106）、黃芩苷對照品（批號 110715-201117）、甘草酸銨對照品 （110731-200615）、五味子醇甲對照品（110857-201211），以上五種對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供）；乙腈（色譜純，迪馬科技有限公司），甲醇（色譜純，迪馬科技有限公司），甲醇（分析純，天津市化學試劑批發公司），乙醇（分析純，天津市化學試劑批發公司），娃哈哈純凈水（天津娃哈哈宏振飲料有限公司），咳喘顆粒 （批號：tl20140507001～tl20140507010，醫內制劑）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相 A 為乙腈，流動相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～30%A；30～50 min，30%～50%A；50～90 min，50%～90%A；90～100 min，90%～100%A；檢測波長237 nm，流速1.0 ml/min，分析時間75 min，進樣量 10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、甘草酸銨、五味子醇甲對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為 0.05、0.1、0.04、0.085、0.18 mg/ml的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取咳喘顆粒約5.0 g，置50 ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，回流提取60 min，放冷，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，續濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 系統適用性試驗

分別取供試品（tl20140507001）和對照品溶液進樣，記錄237 nm波長下色譜圖。對保留時間和紫外光譜圖進行對比可知 6、7、10、15、16 號峰分別是芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、甘草酸銨、五味子醇甲。10號峰（黃芩苷）10批供試品均有，峰型好，峰位適中，與相鄰峰分離良好。因此作為參照物峰，如圖1、圖2。在此條件下，理論塔板數以黃芩苷計算＞2500。

圖1 批號（tl20140507001）樣品HPLC色譜圖

圖2 對照品HPLC色譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 精密取樣品（tl20140507001）溶液，連續進樣6次，按“2.1”項色譜條件測定，考察各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.51%，相對峰面積的RSD為1.24%～2.76%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 精密取樣品（tl20140507001）溶液，分別于 0、4、8、16、24、48 h，按“2.1”項下色譜條件測定，以10號峰（黃芩苷）為參照峰，考察各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.46%，相對峰面積的RSD為0.78%～2.12%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.5.3 重復性試驗 取樣品（tl20140507001）溶液，精密稱取5份，按照“2.3”下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以10號峰（黃芩苷）為參照峰，考察各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.37%，相對峰面積的RSD為1.05%～2.47%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.6 標定共有峰

對10批咳喘顆粒進行檢測，記錄色譜圖，以共有率100%記，共有16個共有峰，10批咳喘顆粒HPLC圖譜各共有峰相對保留時間除11號 （1.5189）、13號（1.7136）、14 號（2.6392），其余均<1.0，符合指紋圖譜要求，結果見表1、表2。

2.7 建立指紋圖譜共有模式

將10批咳喘顆粒HPLC色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版），以S5為參照，采用中位數法生成對照圖譜和共有模式圖譜，如圖3。

圖3 10批咳喘顆粒樣品HPLC色譜圖

表1 10批樣品的共有峰的峰面積

表2 10批樣品指紋圖譜相對保留時間

2.8 指紋圖譜相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版）對上述10批咳喘顆粒樣品進行特征圖譜相似度計算，結果見表3。結果顯示，10批咳喘顆粒相似度評價結果均＞0.96，直觀說明各批次咳喘顆粒之間無明顯差異性，本方法可用于鑒別咳喘顆粒的整體質量。

表3 10批樣品指紋圖譜相似度計算結果

3 討論

3.1 指紋圖譜檢測波長的確定

考察了咳喘顆粒主要成分，參照相關文獻[13-21]，分別對 210、237、250、294 nm 進行篩選。 210、290 nm 出峰較少，且出峰時間較晚。250 nm出峰較多，但是基線漂移。237 nm時出峰多、分離度好、基線平，因此選237 nm為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本實驗首先對等度洗脫與梯度洗脫進行選擇，結果等度洗脫分離度不如梯度洗脫好，因此選擇梯度洗脫。其次，對甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水四種流動相進行選擇，結果甲醇-磷酸、乙腈-磷酸峰型較甲醇-水、乙腈-水好，且基線平，乙腈-磷酸較甲醇-磷酸出峰多。因此，流動相選擇乙腈-磷酸梯度洗脫。

3.3 提取條件的選擇

本實驗首先對不同提取方法（超聲提取方法和加熱回流提取方法）進行選擇，結果回流提取較超聲提取出峰多且峰型好，因此選擇回流提取。其次對提取溶劑進行選擇，樣品分別加50 ml 25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇、75%乙醇、純甲醇、純乙醇溶液加熱回流提取，結果50%甲醇提取出峰最完全，分離度最好，所以選擇50%甲醇提取。最后考察提取時間，分別用 50%甲醇回流提取 15、30、45、60 min，結果超聲30 min，樣品出峰最完全，所以選擇30 min。因此，最終提取條件為50%甲醇回流提取30 min。

3.4 參照峰的確定

通過比較對照發現，6號峰是芍藥苷對照品峰，為咳喘顆粒白芍的主成分峰，峰面積大，但由于有拖尾現象；7號基線不平且分離度不好；15、16號峰峰型較小；因此6、7、15、16均不宜作參照峰；而10號峰峰面積較大，出峰時間較穩定，基線較平，因此選作參照峰。

[1]杜冠華，王月華，張冉，等.多成分多靶點是對中藥作用機制的表面認識[J].世界科學技術（中醫藥現代化），2009，11（4）：480-484.

[2]劉麗寧.傳統中藥臨床用藥優勢之一多靶點探討[J].時珍國醫國藥，2010，21（3）：745-746.

[3]楊義芳，蕭偉.基于多成分多靶點的中藥藥動/藥效相關性研究解讀與策略[J].中草藥，2013，44（12）：1521-1528.

[4]郝旭亮，張永文.中藥質量標準中建立多指標含量測定的必要性淺析[J].中國執業藥師，2009，6（9）：31-33.

[5]張萍，楊燕，鄢丹，等.多指標成分含量測定與指紋圖譜分析在中藥制備工藝與質量控制中的應用[J].中華中醫藥雜志，2010，25（1）：120-123.

[6]孫國祥，胡玥珊，張春玲，等.構建中藥數字化指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志，2009，29（1）：160-169.

[7]王樂，李素霞，陳晶.中藥指紋圖譜在中藥質量控制中的應用[J].河北化工，2010，33（1）：71-73.

[8]李芳.對中藥制劑色譜指紋圖譜的鑒別[J].當代醫藥論叢，2014，12（3）：154.

[9]唐先明，何志一，剛宏林.中藥指紋圖譜在藥品質量控制中的應用[J].中醫藥學報，2014，42（2）：86-88.

[10]李鳳麗，李進，吳嬌.指紋圖譜技術在中藥領域研究中應用現狀[J].天津藥學，2014，12（3）：52-57.

[11]陳志華.高效液相色譜法在中藥指紋圖譜中的應用[A]//2006天津市第十七屆色譜學術交流會論文集[C].2006.

[12]孫波，孫濤.高效液相色譜法在中藥指紋圖譜中的應用現狀及分析[J].時珍國醫國藥，2006，17（1）：109-110.

[13]楊德斌，仝燕，馬振山，等.HPLC法同時測定小兒平喘祛痰顆粒中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷含量[J].中國中藥雜志，2013，38（5）：687-690.

[14]王蘇會，閆薈，孫曉迪，等.HPLC測定小兒感冒丹中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（6）：145-147.

[15]周剛，呂慶紅.高效液相色譜法測定甘芍顆粒中甘草苷和甘草酸的含量[J].中南藥學，2013，11（3）：227-229.

[16]李翠，徐必學，張永萍，等.甘草中甘草苷的含量測定方法研究[J].時珍國醫國藥，2009，20（3）：564-565.

[17]李立順，時維靜，王貴陽.3種五味子藥材HPTLC鑒別與 HPLC 含量測定[J].時珍國醫國藥，2011，22（7）：1698-1699.

[18]盧日剛，唐敏玲，韋向紅.健脾止瀉散中厚樸酚與和厚樸酚的含量測定[J].中國藥事，2004，18（6）：41-43.

[19]方季惟，張紅玉，黃國柱，等.消瘰顆粒醇提干浸膏中黃芩苷含量的HPLC法測定[J].嘉興學院學報，2013，25（6）：117-120.

[20]張志勇，宋曉寧，茅向軍.芩暴紅止咳膠囊中紫丁香苷杜鵑素黃芩苷含量的高效液相色譜測定[J].時珍國醫國藥，2013，24（11）：2603-2604.

[21]尹香閣，田效志，熊晶晶，等.清膽和胃丸中芍藥苷和黃芩苷含量測定的研究[J].中醫學報，2014，29（1）：82-85.