同源重組相關蛋白XRCC3對食管鱗癌細胞放療敏感性的影響及其分子機制研究*

錢　東　郭藝航　曾憲亮　王歡歡　吳志強　孟茂斌　王　平　袁智勇

·基礎研究·

同源重組相關蛋白XRCC3對食管鱗癌細胞放療敏感性的影響及其分子機制研究*

錢東郭藝航曾憲亮王歡歡吳志強孟茂斌王平袁智勇

目的：探討同源重組相關蛋白XRCC3對食管鱗癌（esophageal squmaous cell carcinoma，ESCC）細胞放療敏感性的影響及其潛在的分子機制。方法：利用免疫印跡（Western blot），逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription PCR，RT-PCR）及免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）分別檢測食管鱗癌細胞以及患者石蠟封存組織標本中XRCC3的表達；利用慢病毒感染的方式構建穩定沉默XRCC3表達的食管鱗癌細胞株；運用流式細胞儀通過Annexin V-PI雙染檢測細胞凋亡；免疫熒光染色法檢測細胞DNA損傷以及端粒損傷水平的變化。結果：與正常食管鱗狀上皮細胞或組織相比，XRCC3在食管鱗癌細胞及組織中呈高表達；流式及相關實驗揭示沉默XRCC3的表達會增加食管鱗癌細胞在放療的作用下DNA損傷以及端粒損傷的發生并提高了細胞凋亡的發生比例。結論：XRCC3通過保護端粒的穩定減少了電離輻射所致的細胞DNA損傷以及細胞凋亡，最終導致食管鱗癌細胞對放療的相對抵抗，靶向XRCC3可能成為提高食管鱗癌細胞放療敏感性的有效策略。

食管鱗癌XRCC3放療凋亡端粒穩定

Correspondence to:Zhiyong YUAN;E-mail:zhiyong0524@163.com

Department of Radiotherapy,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,300060,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81401948)

食管鱗癌是中國食管癌的主要發病類型，5年生存率不超過30%［1］。大多數食管鱗癌患者在確診時就處于疾病的進展期，放療聯合化療成為患者的常規治療手段［2］。然而食管鱗癌患者對放化療的整體反應性較差，同時也缺乏能夠預測放化療反應性的相關分子。就目前而言，食管鱗癌的放化療初治完全緩解率及其TNM臨床分期是僅有的被廣泛接受的評價其預后的相關因素［3］，所以，尋找可以預測患者放化療效果及其預后的可靠分子標志物對改善臨床治療效果就顯得十分必要。XRCC3（X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 3），作為Rad51旁系同源家族基因的重要一員，參與了哺乳動物細胞雙鏈DNA損傷的同源重組修復［4］，此外，XRCC3參與的同源重組（homologous recombination，HR）過程對于維持細胞端粒的動態平衡十分關鍵［5］。本研究前期發現端粒結合蛋白PinX1可以調控XRCC3表達并影響食管鱗癌細胞的放療敏感性［6］，但二者之間的因果關系并不明確，XRCC3對食管鱗癌細胞放療敏感性的影響也無相關報道。本研究旨在探索XRCC3對食管鱗癌細胞放療敏感性的影響及其潛在分子機制。

1　材料與方法

1.1材料

從天津醫科大學腫瘤醫院收集的20例食管鱗癌和正常食管鱗狀上皮組織均通過食管鏡鏡檢獲取并經過病理學確診。

食管鱗癌細胞系KYSE30，KYSE150，KYSE410，KYSE510及原代培養食管鱗狀上皮細胞為謝丹教授（中山大學，華南腫瘤學國家重點實驗室）實驗室惠贈，另外一株食管鱗癌細胞系TE-1購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

流式凋亡檢測抗體購自美國Invitrogen公司，XRCC3兔多抗購買于英國Abcame公司，Phospho-Histone H2AX兔多抗購買于美國Cell Signaling Technology公司，TRF1鼠單抗購買于美國GeneTex公司。GAPDH鼠單抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗購美國自SANTA CRUZ公司。1.2方法

1.2.1細胞培養人食管癌細胞株KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE510采用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液；人食管癌細胞株TE-1采用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液；培養條件是37℃，5%CO2的濕化培養箱（Galaxy CO2細胞培養孵育箱）。待細胞密度達80%～90%后，無菌條件下用0.25%的胰酶消化傳代或按要求收集細胞完成相關實驗。

1.2.2免疫組織化學染色常規石蠟包埋組織，4 μm厚連續切片后脫蠟，梯度酒精水化后進行抗原修復，自然冷卻至室溫。加3%H2O2室溫孵育5～10 min，PBS沖洗。滴加正常山羊血清封閉非特異性抗原后，加一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗。滴加二抗37℃反應15 min，PBS沖洗。DAB顯色。蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。免疫組織化學陽性結果判斷標準：根據陽性染色細胞的染色強度分為3個等級，分別為1、2、3分，根據陽性細胞占細胞總數的比例分為4個等級：0～25%（1分）、25%～50%（2分）、50%～75%（3分）、75%～100%（4分）。將二者的分數相乘的結果即組織的總分（0、1、2、3、4、6、8、9、12），當評分≥6分時，即認為XRCC3為高表達，當評分＜6分時，即認為XRCC3為低表達。病理結果有兩位病理學醫生在不知病例資料的情況下，獨立進行閱片，當出現分歧時，由兩位專家將不同的判斷結果進行重新評估，直到兩位專家得到一致的意見。

1.2.3Western blot檢測通過試劑盒提取細胞總蛋白，蛋白質定量、分離后PVDF膜上免疫雜交，洗滌后將濾膜與標記的抗免疫球蛋白一抗及二抗分別孵育后，利用發光法檢測相關蛋白表達。

1.2.4反 轉 錄 PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）引物設計：XRCC3-F 5'AACCCGCGGGAGAGTCCCCA 3' XRCC3-R 5'AAAGCCTGTGGGAGGCCCGA 3' GAPDH-F 5'GTTCGACAGTCAGCCGCATCT 3' GAPDH-R 5'CCTGCAAATGAGCCCCAGCCT 3'

收集細胞，提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明方法逆轉錄生成cDNA，用上述特異的引物擴增，反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min預變性，95℃ 15 s，60℃1 min，72℃30 s，35個循環，反應結束后瓊脂糖電泳，紫外激發后觀察和拍照。

1.2.5平板克隆實驗細胞分別接種于6孔板中培養10～21天；當6孔細胞培養板中出現肉眼可觀察到的細胞克隆時，棄掉培養基，4%多聚甲醛溶液固定10 min；Gimsa液染色后倒置顯微鏡下計數各孔細胞總數≥50個的集落數。

1.2.6流式細胞儀Annexin-V/PI雙標記法檢測細胞凋亡準備細胞并調整待檢測細胞濃度為106個/mL，加入Annexin-V-FITC及PI。利用流式細胞儀488 nm激發波長測定Annexin V熒光，620 nm帶通濾片檢測PI熒光。每樣本收集多于10 000個熒光信號。結果判定：以AnnexinV為橫軸，PI為縱軸；左上象限分布的為機械性損傷細胞；右上象限分布的為晚期凋亡細胞或者壞死細胞；左下象限分布的為陰性正常細胞；右下象限分布的為早期凋亡細胞。

1.2.7免疫熒光檢測端粒末端損傷在6孔板或十二孔板中爬玻璃片接種細胞，根據實驗設計來分組。4%多聚甲醛室溫固定后加入1%Triton-X100通透細胞；10%正常山羊血清封閉后加一抗TRF1和γ H2AX雙染；熒光二抗染色后，DAPI染核。封片，然后共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。TIF陽性細胞的計算：TRF1和γH2AX共定位的點代表端粒功能障礙誘導的損傷灶（telomere dysfunction induced foci，TIF）。至少數400個細胞，每個細胞多于5個TRF1和γ H2AX共定位的點認為是TIF陽性的細胞［7］。

1.3統計學分析

實驗所得數據采用SPSS 17.0統計學軟件處理，數據以x±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05定義為有統計學意義。

2　結果

2.1XRCC3在食管鱗癌細胞和食管鱗癌組織中呈高表達

RT-PCR以及免疫印跡實驗結果顯示，與正常食管黏膜上皮細胞比較，無論是在mRNA水平（圖1A）還是在蛋白水平（圖1B），XRCC3在5株食管鱗癌細胞系中均呈高表達。通過免疫組織化學檢測（圖1C，D），XRCC3在20例食管鱗癌組織中有14例呈高表達，占總數的70%；而在20例正常食管黏膜組織中，只有5例高表達，占總數的25%，二者之間存在統計學顯著性差異（圖1E，P＜0.01）。

2.2干擾XRCC3的表達促進食管鱗癌細胞在放療作用下凋亡的發生

選擇兩株食管鱗癌細胞系KYSE 30和TE-1，利用慢病毒感染的方式構建干擾XRCC3表達以及空白對照的穩定細胞系（KYSE 30-shXRCC3，KYSE 30-Control，TE-1-shXRCC3，TE-1-Control，圖2A），平板克隆實驗結果顯示：干擾XRCC3的表達并不會影響細胞的克隆形成能力（圖2B）。凋亡是電離輻射所致細胞死亡的主要方式，流式凋亡檢測的結果顯示，下調XRCC3的表達會促進KYSE 30以及TE-1在放療的作用下發生凋亡（圖2C）。提示下調XRCC3的表達會增加食管鱗癌細胞的放療敏感性。

2.3干擾XRCC3的表達對食管鱗癌細胞凋亡通路及同源重組通路相關蛋白的影響

進一步檢測了反映細胞凋亡通路的常見蛋白PARP及Caspase-3的變化，結果顯示，沉默XRCC3的表達會導致放療作用下TE-1和Kyse 30細胞中剪切體 PARP（Cleaved-PARP）和 剪 接 體 Caspase-3 （Cleaved-Caspase-3）表達的增加（圖3A）。同時，Western blot的結果提示，干擾XRCC3的表達會引起同源重組修復相關蛋白XRCC2和Rad51C表達的下調，而其他的相關基因并無變化（圖3B）。

2.4干擾XRCC3的表達促進食管鱗癌細胞在放療作用下DNA損傷及端粒損傷的發生

r-H2AX會在DNA發生損傷時迅速磷酸化并定位于DNA損傷位點，其被用作DNA損傷的指示標志物而廣泛應用于DNA損傷修復的研究當中。通過免疫熒光的檢測，發現干擾XRCC3的表達會導致食管鱗癌細胞在放療的作用下磷酸化的r-H2AX染色出現非常明顯的增加（圖4A，B）。進一步通過檢測端粒結合蛋白TRF1與磷酸化r-H2AX的共定位來顯示端粒末端的損傷（TIF，telomere dysfunction induced foci），結果顯示，下調XRCC3的表達增加了食管鱗癌細胞在放療的作用下端粒末端損傷的發生（圖4A，C）

圖1　XRCC3在食管鱗癌細胞和食管鱗癌組織中的表達水平（H&E×200）Figure 1　Expression of XRCC3 in ESCC cell lines and tissues（H&E×200）

圖2　沉默XRCC3的表達對放療所致食管鱗癌細胞凋亡的影響Figure 2　Silencing of XRCC3 promoted ionizing radiation-induced apoptosis in ESCC cells

圖3　沉默XRCC3的表達對放療作用下食管鱗癌細胞凋亡相關蛋白及同源重組通路相關蛋白表達的影響Figure 3　Silencing of XRCC3 promoted ionizing radiation-induced cleavage of PARP and caspase-3，as well as inhibited the expression of XRCC2 and Rad51c

圖4　干擾XRCC3的表達對食管鱗癌細胞在放療作用下DNA損傷及端粒損傷的影響（×1 000）Figure 4　Silencing of XRCC3 promoted ionizing radiation-induced DNA damage and telomere dysfunction in both Kyse30 and TE-1 cells（×1000）

3　討論

對于食管鱗癌患者而言，無論是根治性治療還是姑息治療，放療都扮演重要的甚至是核心的作用［7-9］。隨著分子腫瘤學的飛速發展，從分子水平來改變腫瘤細胞治療反應的結果成為趨勢。但是，關于與患者放療敏感性相關的腫瘤分子遺傳學的研究卻十分有限。尋找到更多更精確的可以預測以及調控腫瘤放療反應的分子標志物（molecular biomarkers），無論對于食管鱗癌還是其他需要接受放療的腫瘤都具有重要意義，也任重而道遠。

XRCC3作為同源重組相關基因家族成員之一，參與了雙鏈DNA損傷修復的過程。本研究顯示，無論是在食管鱗癌細胞還是組織中，XRCC3都呈高表達，而在食管鱗癌細胞中干擾XRCC3的表達會增加細胞對放療的敏感性。起源于嚴重的無法完全修復的DNA損傷或者說基因組的破壞和不穩定的凋亡被認為是大多數實體腫瘤放射致死的主要機制［10］。本研究的結果顯示，在食管鱗癌細胞中干擾XRCC3的表達顯著增加了放療作用下細胞凋亡的發生，凋亡通路蛋白PARP及Caspase-3的激活也明顯增加。這提示食管鱗癌細胞中XRCC3的高表達可能通過抑制電離輻射作用下細胞凋亡通路的激活從而阻止細胞凋亡的發生，最終導致細胞對放療的相對抵抗。本結果顯示，干擾XRCC3的表達還可以導致其他同源重組相關基因（XRCC2，Rad51c）蛋白水平的下調。表明XRCC3關系著整個細胞同源重組修復通路的穩定，這與先前的報道一致［11-12］。

電離輻射導致細胞凋亡的最主要原因是其直接損傷細胞的DNA，本研究明確顯示，在食管鱗癌細胞中干擾XRCC3的表達會導致細胞在放療的作用下DNA損傷明顯增加。電離輻射會導致細胞DNA多種類型的損傷，包括DNA單鏈損傷，DNA雙鏈損傷等，在多種損傷類型當中，DNA雙鏈損傷（DSB）被認為是最嚴重、最難修復的一種，一旦DSB沒有被修復，會導致細胞在下一個分裂周期或多個分裂周期后發生凋亡和死亡。當這種損傷被錯誤地修復后，細胞染色體發生異常和不穩定而最終可能引發細胞的惡性轉化，與腫瘤的發生密切相關［13］。對于DNA雙鏈損傷，細胞通過多種機制進行修復，最常見的是非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）修復和同源重組修復（homologous recombination repair，HRR［14］。以往的研究表明非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）修復在電離輻射所致的雙鏈DNA損傷中扮演著重要的角色，同源重組（Homologous recombination，HR）只起著次要的作用［15-17］。但是，有研究提示同源重組除了參與DNA損傷修復以外，還有一個作用就是參與細胞端粒D-Loop環的形成，對于端粒的穩定與否至關重要［5］。端粒功能障礙會導致異常的染色體末端融合，而這種異常的融合會引發基因組的不穩定，端粒穩定性是維持幾乎所有的腫瘤細胞正常生長增殖所必須的。許多研究都表明端粒穩定性的破壞可以使得腫瘤細胞對化療藥物和電離輻射更加敏感［18-19］。進一步研究結果也正好提示了這一點，發現干擾XRCC3的表達增加了食管鱗癌細胞在放療的作用下端粒末端損傷。XRCC3表達的下調可能通過損傷了細胞同源重組能力而導致腫瘤細胞端粒的失保護，影響了細胞對電離輻射的敏感性。

綜上所述，本研究發現XRCC3在食管鱗癌細胞中呈高表達，而干擾XRCC3的表達會導致細胞在電離輻射的作用下端粒不穩定性及DNA損傷的增加，其結局是放療后細胞凋亡的增加，最終增強了細胞的放療敏感性。因此，靶向XRCC3及其參與的同源重組通路將可能成為提高食管鱗癌患者放射增敏的有效策略。

1 Pennathur A，Gibson MK，Jobe BA，et al.Oesophageal carcinoma ［J］.Lancet，2013，381（9864）：400-412.

2 Lloyd S，Chang BW.Current strategies in chemoradiation for esophageal cancer［J］.J Gastrointest Oncol，2014，5（3）：156-165.

3 Napier KJ，Scheerer M，Misra S.Esophageal cancer：A Review of epidemiology，pathogenesis，staging workup and treatment modalities［J］.World J Gastrointest Oncol，2014，6（5）：112-120.

4 Pierce AJ，Johnson RD，Thompson LH，et al.XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells［J］. Genes Dev，1999，13（20）：2633-2638.

5 Wang RC，Smogorzewska A，de Lange T.Homologous recombination generates T-loop-sized deletions at human telomeres［J］.Cell，2004，119（3）：355-368.

6 Qian D，Zhang B，He LR，et al.The telomere/telomerase binding factor PinX1 is a new target to improve the radiotherapy effect of oesophageal squamous cell carcinomas［J］.J Pathol，2013，229（5）：765-774.

7 Takai H，Smogorzewska A，de Lange T.DNA damage foci at dysfunctional telomeres［J］.Curr Biol，2003，13（17）：1549-1556.

8 Li B，Zhang WC，Zhao LJ，et al.Therapeutic strategy to prevent the recurrence of esophageal carcinoma after radical resection［J］. Chinese Journal of Clinical Oncology，2013，40（24）：1553-1557.［李博，章文成，趙路軍，等.食管癌根治術后復發的治療策略［J］.中國腫瘤臨床，2013，40（24）：1553-1557.］

9 Berger B，Belka C.Evidence-based radiation oncology：oesophagus ［J］.Radiother Oncol，2009，92（2）：276-290.

10 Eriksson D，Stigbrand T.Radiation-induced cell death mechanisms ［J］.Tumour Biol，2010，31（4）：363-372.

11 Lio YC，Schild D，Brenneman MA，et al.Human Rad51C deficiency destabilizes XRCC3，impairs recombination，and radiosensitizes S/G2-phase cells［J］.J Biol Chem，2004，279（40）：42313-42320.

12 Griffin CS，Simpson PJ，Wilson CR，et al.Mammalian recombination-repair genes XRCC2 and XRCC3 promote correct chromosome segregation［J］.Nat Cell Biol，2000，2（10）：757-761.

13 Curtin NJ.DNA repair dysregulation from cancer driver to therapeutic target［J］.Nat Rev Cancer，2012，12（12）：801-817.

14 Kakarougkas A，Jeggo PA.DNA DSB repair pathway choice：an orchestrated handover mechanism［J］.Br J Radiol，2014，87（1035）：20130685.

15 Wang C，Lees-Miller SP.Detection and repair of ionizing radiation-induced DNA double strand breaks：new developments in nonhomologous end joining［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2013，86（3）：440-449.

16 Chiruvella KK，Liang Z，Wilson TE.Repair of double-strand breaks by end joining［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2013，5 （5）：a012757.

17 Rass E，Grabarz A，Bertrand P，et al.Double strand break repair，one mechanism can hide another：alternative non-homologous end joining［J］.Cancer Radiother，2012，16（1）：1-10.

18 Wong KK，Chang S，Weiler SR，et al.Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation［J］. Nat Genet，2000，26（1）：85-88.

19 Sabatino L，Picano E，Andreassi MG.Telomere shortening and ionizing radiation：a possible role in vascular dysfunction［J］？Int J Radiat Biol，2012，88（11）：830-839.

（2014-09-10收稿）

（2014-12-13修回）

（本文編輯：周曉穎）

錢東專業方向為腫瘤的放射治療。E-mail：qiankeyu1984@126.com

Effects and underlying mechanisms of homologous recombination-associated protein XRCC3 on esophageal squamous-cell carcinoma radiotherapy response

Dong QIAN,Yihang GUO,Xianliang ZENG,Huanhuan WANG,Zhiqiang WU,Maobin MENG,Ping WANG,Zhiyong YUAN

Objective:To investigate the effects and underlying mechanisms of XRCC3 on esophageal squamous-cell carcinoma (ESCC)radiotherapy response.Methods:Expression levels of XRCC3 were detected by reverse transcription PCR,Western blot,and immunohistochemistry.We knocked down XRCC3 with lentiviral infection in ESCC cells.Cell apoptosis was examined by flow cytometry.DNA damage and telomere dysfunction-induced foci were determined by immunofluorescence.Results:The expression levels of XRCC3 in ESCC cells and tissues were higher than those in normal esophageal epithelial cells and corresponding adjacent noncancerous esophageal tissues.Knockdown of XRCC3 in ESCC cells substantially increased the therapeutic efficacy of radiation.We demonstrated that the radiation resistance of XRCC3 was attributed to the XRCC3-maintaining telomere stability,which reduced ESCC cell death through radiation-induced apoptosis.Conclusion:Our data suggested that XRCC3 protects ESCC cells from ionizing radiation-induced DNA damage and death by enhancing telomere stability.Thus,XRCC3 can be used as a promising therapeutic target for ESCCs.

esophageal squamous-cell carcinoma,XRCC3,radiotherapy,apoptosis,telomere stability

10.3969/j.issn.1000-8179.20141557

天津醫科大學腫瘤醫院放射治療科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）*本文課題受國家自然科學基金青年科學基金項目（編號：81401948）資助

袁智勇zhiyong0524@163.com