檜木醇誘導(dǎo)人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究*

倪曉辰　趙志紅　馬永良　任宗濤　劉　彬　樊　博　衛(wèi)書飛　張愛(ài)莉

·基礎(chǔ)研究·

檜木醇誘導(dǎo)人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究*

倪曉辰趙志紅馬永良任宗濤劉彬樊博衛(wèi)書飛張愛(ài)莉

目的：探討檜木醇（hinokitiol）對(duì)人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞株的增殖抑制作用及誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，初步闡明其機(jī)制。方法：采用CCK-8法檢測(cè)檜木醇對(duì)腎癌786-O細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；轉(zhuǎn)染EGFP-LC3后鏡下觀察細(xì)胞自噬狀態(tài)；采用Western blot對(duì)細(xì)胞Caspase-3剪切體、LC3和P62蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：檜木醇可以顯著抑制腎癌786-O細(xì)胞增殖，通過(guò)激活Caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檜木醇誘導(dǎo)腎癌786-O細(xì)胞發(fā)生自噬，LC3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而P62蛋白表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：檜木醇可顯著抑制腎癌786-O細(xì)胞的增殖并通過(guò)過(guò)度激活細(xì)胞自噬促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡。

檜木醇腎癌凋亡增殖自噬

Correspondence to:Aili ZHANG,E-mail:z13930409899@163.com

Department of Urology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China

This work was supported by the Key Research Project of Medical Science in Hebei Province(No.20110142)

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤患者中，腎癌患者約占2%，每年全球新發(fā)腎癌患者超過(guò)20萬(wàn)例［1］，據(jù)估計(jì)2014年全美新發(fā)腎臟腫瘤患者將會(huì)達(dá)到63 920例，而死于腎臟腫瘤的患者數(shù)量將會(huì)達(dá)到13 860例［2］。雖然傳統(tǒng)的外科手術(shù)治療和近年來(lái)興起的靶向治療顯著提高了腎癌患者的生存率，但腎癌作為人類主要的惡性腫瘤之一仍舊嚴(yán)重威脅著大眾健康，需進(jìn)一步探索更多行之有效的治療方法。檜木醇（hinokitiol）是從柏科植物提取的一種天然化合物［3］，目前已知檜木醇具有誘導(dǎo)分化、抗真菌和細(xì)菌、抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性［4-8］，而最近的研究發(fā)現(xiàn)檜木醇也具有顯著的抗腫瘤活性，并且該抗腫瘤作用與其導(dǎo)致DNA損傷和凋亡誘導(dǎo)作用有關(guān)［9-11］。本研究旨在明確檜木醇的抗腎癌作用并初步探明其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人腎癌細(xì)胞株786-O購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；EGFP-LC3質(zhì)粒由日本大阪大學(xué)Tamotsu Yoshimori教授惠贈(zèng)；檜木醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8購(gòu)自日本東仁化學(xué)研究所；Z-VAD-FMK及3-MA購(gòu)自美國(guó)Enzo公司；本研究所使用抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Lipofectamine 2000為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞傳代接種于96孔板內(nèi)，100 μL/孔，待細(xì)胞貼壁后依實(shí)驗(yàn)所需加入不同濃度藥物，培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后分別加入10 μL/孔CCK-8，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，實(shí)時(shí)觀察，酶標(biāo)儀450 nm比色。

1.2.3Annexin V/PI凋亡檢測(cè)給予相應(yīng)藥物作用后的細(xì)胞常規(guī)消化離心，PBS洗滌后，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸，分別加入Annexin V和PI各5 μL，混勻后避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。1.2.4Western blot檢測(cè)收集細(xì)胞后裂解，蛋白定量，加入上樣緩沖液后煮樣變性，SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜，一抗封閉過(guò)夜，次日二抗室溫封閉1 h，ECL化學(xué)發(fā)光，拍照存檔。

1.2.5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞傳代至激光共聚焦專用平皿內(nèi)，貼壁后換成無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)基，使用EGFP-LC3質(zhì)粒及Lipofectamine 2000制備脂質(zhì)體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染6 h后換液，24 h后觀察轉(zhuǎn)染效果，將細(xì)胞分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組給予DMSO，實(shí)驗(yàn)組給予相應(yīng)藥物，激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照存檔。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用x±s表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　檜木醇抑制腎癌786-O細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Figure 1　Hinokitiol inhibition on the proliferation of 786-O cells and induction of cell apoptosis

2　結(jié)果

2.1檜木醇對(duì)腎癌786-O細(xì)胞增殖及凋亡的影響

CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檜木醇處理腎癌786-O細(xì)胞24 h后，藥物濃度為2.5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖活力受到了明顯的抑制（P＜0.01），并且隨著給藥濃度（2.5、5.0、10.0 μmol/L）的增加，腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增加（36.7%、71.8%、87.9%），見(jiàn)圖1A。為了更進(jìn)一步研究檜木醇是否可以誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞死亡，使用Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞死亡率（圖1B），在給予2.5 μmol/L檜木醇作用腎癌786-O細(xì)胞24和48 h后，腎癌細(xì)胞死亡率明顯上升，Annexin V+/PI-細(xì)胞比率分別上升至1.01%和4.94%，Annexin V+/PI+比率分別上升至5.88%和25.4%。Caspase-3是凋亡最終的主要執(zhí)行者之一，Caspase-3剪切體是Caspase-3的活性形式，其含量的高低可以直接說(shuō)明細(xì)胞的凋亡情況。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞Caspase-3剪切體蛋白的含量出現(xiàn)了明顯的升高（圖1C）。Z-VAD-FMK是Caspase蛋白的廣譜抑制劑，可以抑制Caspase蛋白的激活，從而抑制凋亡的發(fā)生。為了進(jìn)一步說(shuō)明檜木醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否和Caspase途徑有關(guān)，本研究使用了這一抑制劑進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明2.5 μmol/L檜木醇作用細(xì)胞24 h之后，Z-VAD-FMK可以顯著抑制藥物對(duì)腎癌786-O細(xì)胞的凋亡作用（P＜0.01，圖1D）。

2.2檜木醇誘導(dǎo)腎癌786-O細(xì)胞LC3蛋白酯化及自噬體形成

將EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎癌786-O細(xì)胞，待其穩(wěn)定表達(dá)后，給予細(xì)胞2.5 μmol/L的檜木醇進(jìn)行處理，激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示在給藥6 h后，細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光點(diǎn)數(shù)較對(duì)照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2A）。使用Western blot檢測(cè)腎癌786-O細(xì)胞LC3蛋白和自噬特異性底物P62蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果表明隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3-II蛋白的表達(dá)量明顯上升，P62蛋白的表達(dá)量明顯下降（圖2B）。

2.3檜木醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬的關(guān)系

為了更進(jìn)一步說(shuō)明檜木醇引起的細(xì)胞自噬與凋亡之間的關(guān)系，本研究使用了自噬的上游抑制劑3-MA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖3A），3-MA（2 mmol/L）抑制了細(xì)胞自噬活動(dòng)，24 h可以部分逆轉(zhuǎn)2.5μmol/L檜木醇的抗腫瘤作用（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也提示3-MA（2 mmol/L）24 h可以部分拮抗檜木醇（2.5 μmol/L）對(duì)于腎癌細(xì)胞的死亡誘導(dǎo)作用（圖3B）。使用Western blot進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在給予3-MA（2 mmol/L）之后，腎癌786-O細(xì)胞的LC3-II表達(dá)量顯著下降，3-MA能夠逆轉(zhuǎn)檜木醇導(dǎo)致的LC3-II表達(dá)量上升，Caspase-3剪切量表達(dá)量也呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)（圖3C，3D）。

圖2　2.5 μmol/L檜木醇于6 h時(shí)對(duì)腎癌786-O細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)Figure 2　Hinokitiol（2.5 μmol/L，6 h）induction of autophagy in the 786-O cells

圖3　檜木醇誘導(dǎo)細(xì)胞自噬對(duì)細(xì)胞凋亡的作用Figure 3　Effects of hinokitiol induction on cell apoptosis via autophagy

3　討論

自噬是近年來(lái)生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。自噬是細(xì)胞最基本的生理活動(dòng)，在維持細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面有著重要的作用。自噬泡內(nèi)的物質(zhì)被溶酶體所含有的酸性水解酶水解成氨基酸、核酸、糖原和脂肪酸等小分子物質(zhì)，重新釋放至胞質(zhì)內(nèi)參與物質(zhì)的再循環(huán)或者為代謝供能［12］。

自噬在腫瘤中的作用異常復(fù)雜，目前仍不是十分清楚［13］。在正常生理狀態(tài)下自噬具有抑制腫瘤發(fā)生的作用，機(jī)制主要是由于自噬可以清除錯(cuò)誤折疊的蛋白、細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS和受損的線粒體，從而間接維持DNA的完整性和基因組的穩(wěn)定性。當(dāng)腫瘤形成后，自噬又促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的存活，自噬可以提供給腫瘤細(xì)胞更多的能量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，賦予了腫瘤細(xì)胞在低氧、低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下更強(qiáng)的生存優(yōu)勢(shì)［14］。以自噬為靶點(diǎn)的腫瘤治療已經(jīng)成為近年來(lái)腫瘤治療研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

自噬與凋亡之間存在著非常復(fù)雜的關(guān)系，機(jī)制仍舊不明。當(dāng)自噬過(guò)程受到抑制時(shí)，細(xì)胞由于代謝嚴(yán)重障礙及合成底物嚴(yán)重不足，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡，而當(dāng)自噬過(guò)程過(guò)度激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)由于過(guò)度消耗，也可以導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡［15］。LC3蛋白是自噬檢測(cè)的標(biāo)志蛋白之一，前體LC3蛋白合成之后經(jīng)過(guò)加工修飾形成LC3-I型蛋白，自噬活化時(shí)LC3-I酯化形成LC3-II型蛋白，并定位于自噬泡。本研究使用了EGFP-LC3質(zhì)粒，這一質(zhì)粒經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后表達(dá)綠色熒光EGFP-LC3融合蛋白，通過(guò)觀察綠色熒光可以定位胞內(nèi)的LC3。低自噬水平狀態(tài)下，EGFP-LC3在胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)綠色彌散分布，自噬激活時(shí)，EGFP-LC3定位于自噬泡上，呈現(xiàn)明顯的點(diǎn)狀分布。結(jié)果表明檜木醇可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)檜木醇激活細(xì)胞自噬的時(shí)間（6 h）明顯早于凋亡的發(fā)生時(shí)間（24 h），同時(shí)P62蛋白的表達(dá)量在給藥之后也明顯下降。由于P62蛋白是自噬的特異性底物，所以推測(cè)檜木醇引起的腎癌786-O細(xì)胞凋亡很可能是由于細(xì)胞自噬過(guò)度激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)過(guò)度消耗所致。為了進(jìn)一步解釋這一問(wèn)題，本研究使用自噬抑制劑3-MA進(jìn)行研究，當(dāng)給予3-MA從上游抑制細(xì)胞自噬之后不僅能夠抑制檜木醇的自噬激活作用，還能夠部分抑制檜木醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，這一結(jié)果更加說(shuō)明其作用機(jī)制與自噬密切相關(guān)。

從天然植物中分離提純抗腫瘤化合物對(duì)于腫瘤的治療具有廣闊的應(yīng)用前景。檜木醇作為一種天然植物提取物，其抗腫瘤作用研究目前還不夠深入，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)其具有抗乳腺癌、肺癌和直腸癌的作用［10，11，16］。本研究從體外水平證明了檜木醇的抗腎癌作用，并且發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡作用與自噬過(guò)程的過(guò)度激活有關(guān)，進(jìn)一步豐富了檜木醇的抗腫瘤譜，并初步說(shuō)明了其作用機(jī)制，為該藥物的未來(lái)開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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（2014-08-19收稿）

（2014-12-21修回）

（編輯：張亻 刡）

倪曉辰專業(yè)方向?yàn)槟行悦谀蛏诚到y(tǒng)腫瘤的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)相關(guān)研究。

E-mail：nixiaochenhb@163.com

Hinokitiol induces clear cell renal cancer 786-O cell apoptosis via autophagy induction

Xiaochen NI,Zhihong ZHAO,Yongliang MA,Zongtao REN,Bin LIU,Bo FAN,Shufei WEI,Aili ZHANG

Objective:To investigate the effects of hinokitiol on the proliferative inhibition and apoptosis induction in human clear cell renal cancer 786-O cells.Methods:CCK-8 assays were performed to analyze the effects of hinokitiol on the proliferation of 786-O cells.The apoptosis rate was determined by flow cytometry.EGFP-LC3 microscopy assays were performed to assess the autophagy flux.Cleaved Caspase-3,LC3,and P62 were detected by Western blot.Results:Hinokitiol could inhibit the proliferation of the 786-O cells and could induce cell apoptosis via Caspase pathway.Hinokitiol induced the autophagy of 786-O cells,increased LC3 expression,and downregulated P62 expression.Conclusion:Hinokitiol can inhibit the proliferation of 786-O cells and can induce cell apoptosis via autophagy induction.

hinokitiol,renal cancer,apoptosis,proliferation,autophagy

10.3969/j.issn.1000-8179.20141412

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院泌尿外科（石家莊市050011）

*本文課題受河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃（編號(hào)：20110142）資助

張愛(ài)莉z13930409899@163.com