膠質瘤miR-29c表達異常減少及其對腫瘤細胞增殖的影響*

石翠娟　王　影　于士柱　孫翠云　王　虔　徐　慧　安同嶺　溫艷軍徐金玲　劉　靜　李慧凝

·基礎研究·

膠質瘤miR-29c表達異常減少及其對腫瘤細胞增殖的影響*

石翠娟王影于士柱孫翠云王虔徐慧安同嶺溫艷軍徐金玲劉靜李慧凝

目的：探討microRNA-29c（miR-29c）在膠質瘤中的表達及其對細胞分裂周期蛋白42（CDC42）的調控作用和對細胞增殖的影響。方法：用鎖定寡核苷酸原位雜交法和免疫組織化學法檢測60例不同級別膠質瘤及10例非腫瘤對照腦組織中miR-29c 和CDC42的表達水平，實時熒光定量RT-PCR、Western blot及MTS法分別檢測U87MG細胞中miR-29c瞬時表達、CDC42 mRNA和蛋白表達及其對膠質瘤細胞增殖的影響。結果：各級別膠質瘤的miR-29c表達水平均明顯低于非腫瘤對照腦組織，且隨腫瘤級別升高而顯著降低，各組間的差異均有統計學意義（P＜0.001）。而CDC42表達水平則呈相反趨勢，其表達水平隨膠質瘤良惡性級別增加相應升高，除Ⅰ～Ⅱ級組與非腫瘤對照組之間外，其余各組間的差異均有統計學意義（P＜0.001）。與對照組相比，miR-29c轉染組的CDC42 mRNA（P＜0.001）和蛋白表達水平（P＜0.01）均明顯降低。miR-29c轉染組細胞的增殖能力明顯低于U87MG空白對照組和Scr轉染組（P＜0.05）。結論：miR-29c是膠質瘤的抑瘤miRNA，其表達水平可作為評價膠質瘤良惡性級別的重要參考指標。miR-29c在膠質瘤中表達減少解除了其對靶基因CDC42轉錄后水平的抑制作用，并導致腫瘤細胞無限增殖。表明miR-29c表達異常減少可能是引起膠質瘤發生、發展的關鍵事件。

膠質瘤微小RNA-29c細胞分裂周期蛋白42細胞增殖

Correspondence to:Shizhu YU;E-mail:tjyushizhu@yahoo.com

Department of Neuropathology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin Neurological Institute,Key Laboratory of Post-trauma Neuro-repair and Regeneration in Central Nervous System,Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Injuries,Variations and Regeneration of Nervous System,Tianjin 300052,China.

This work was supported by grants from the National Basic Research Program of China(973 Program,No.2010CB529405),the National Natural Science Foundation of China(No.81202102 and 81402050),the Science and Technology Commission Foundation of Tianjin Municipal(No.12ZCDZSY17400 and 13JCQNJC12100),the Education Commission Foundation of TianjinMunicipal(No.2004ZD06and20110102),theFoundationofChineseSocietyofNeuro-Oncology(No.CSNO-2013-MSD010),and the Foundation of Tianjin Medical University(No.2013KYQ02)

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為20～25 nt、進化上高度保守的小分子非編碼單鏈RNA。miRNA通過有效沉默下游靶基因的表達，在多種生理和病理過程中發揮重要調控作用。已知促瘤miRNAs（Onco-miRNAs）表達異常增加和（或）抑瘤miRNAs（TS-miRNAs）表達異常減少與多種腫瘤的發生、發展密切相關［1-2］。miR-29s家族包括三個成員：hsa-miR-29a、hsa-miR-29b及hsa-miR-29c，分別由位于7q32.3和1q32.2的兩個基因簇編碼。最新研究顯示，miR-29c是一種重要的TS-miRNA，其表達異常減少是導致一些顱外惡性腫瘤細胞無限增殖及腫瘤發生、發展的重要因素［3］。細胞分裂周期蛋白

42（CDC42）屬于小G蛋白家族，具有GTP酶活性，在細胞信號通路中具有分子開關的作用，通過調節多種細胞信號轉導，參與細胞增殖、凋亡等過程的調控［4］。本組前期研究發現，miR-29a表達水平隨膠質瘤良惡性級別的升高而相應降低，并通過下調其靶基因CDC42抑制腫瘤細胞的侵襲遷移［5］。而膠質瘤是否存在miR-29c表達異常，上調miR-29c能否通過敲低CDC42抑制腫瘤細胞增殖均尚不清楚。本研究以不同級別人膠質瘤組織及膠質母細胞瘤細胞系

U87MG為研究對象，探討miR-29c在膠質瘤中的表達及其對膠質瘤細胞增殖的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本收集2000年1月至2009年12月在天津醫科大學總醫院神經外科就診手術切除的膠質瘤組織標本60例，其中，男性36例，女性24例，年齡為12～47歲。所有組織標本按照WHO分類標準（2007年）進行組織學分類和良惡性分級［6］，其中Ⅰ～Ⅱ級組20例，Ⅲ級組20例，Ⅳ級組20例。同時收集外傷減壓術切除的非腫瘤對照腦組織10例，作為非腫瘤對照腦組織組。將上述標本制備成組織微陣列，切制5 μm切片用于miR-29c原位雜交和CDC42免疫組織化學檢測。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.1.2細胞系與主要試劑人膠質母細胞瘤細胞系U87MG購自北京協和醫學院細胞中心。miR-29c鎖定寡核苷酸探針及無義對照探針（大連寶生物工程公司）；羅丹明標記抗地高辛抗體（美國Roche公司）；胎牛血清、培養基、轉染試劑LipofectamineTM2000、轉染優化試劑Opti MEM及Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；miRNA無義對照序列（Scr）、miR-29c mimics 及Hairpin-it miRNA實時定量檢測試劑盒（上海吉瑪制藥技術有限公司）；mRNA反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒、CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent細胞增殖分析（MTS）試劑盒（美國Promega公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；兔抗人CDC42多克隆抗體（武漢博士德公司）；小鼠抗人β-actin單克隆抗體、ABC檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgGⅡ抗（北京中杉金橋公司）。1.2方法

1.2.1鎖定寡核苷酸探針原位雜交鎖定核酸修飾的寡核苷酸探針序列為：5'-TAACCG ATTTCAAATGGTGCTA-3'，無義對照探針序列為：5'-CGTATAGGCCCAAGAATTAGG-3'，二者5'-端均為地高辛標記。切片脫蠟入水，按常規程序雜交（miR-29c探針濃度為5 μg/mL），行羅丹明標記抗地高辛抗體（5 μg/mL）檢測，DAPI復染細胞核（1μg/mL），甘油封片［7］。陰性對照用無義對照探針代替miR-29c探針。應用Leica DM6000B熒光顯微鏡采集微陣列中每例切片的熒光圖像（×400），經Image Pro Plus 5.0軟件分析結果，計算每例切片的miR-29c陽性標記指數（Labeling index，LI%）。陽性標記指數LI%=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.2免疫組織化學切片脫蠟入水，按常規程序行免疫組織化學染色（CDC42 1:150），蘇木素復染細胞核，中性樹膠封片。應用Leica DM6000B顯微鏡采集微陣列中每例切片的圖像（×400），視野選取及LI%計算方法與原位雜交結果判定相同。

1.2.3生物信息學預測采用miRanda和miTarBase生物信息學分析軟件，預測CDC42 mRNA 3'非翻譯序列（3'-UTR）中miR-29c種子序列的互補序列。

1.2.4細胞培養、轉染及分組人膠質母細胞瘤細胞系U87MG細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中常規培養。取對數生長期細胞接種于六孔板，隨機分為miR-29c mimics轉染組（miR-29c組）、miRNA無義對照序列轉染組（Scr組）和空白對照組（U87MG組）。轉染步驟參照LipofectamineTM2000說明書進行，轉染后48 h進行RNA和蛋白的提取。

1.2.5qRT-PCR檢測Trizol法提取各組總RNA。取1 μg總RNA，分別以U6和β-actin mRNA為內參，采用stem-loop及常規qRT-PCR分別檢測miR-29c 和CDC42 mRNA，用2-Δ Δ Ct法計算二者相對表達水平。以上檢測均獨立重復3次。

1.2.6Western blot檢測提取miR-29c組及Scr和空白對照組U87MG細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后各取20μg，按標準程序檢測CDC42蛋白表達水平［8］。用凝膠成像系統檢測各條帶灰度值，將相對灰度值（目的條帶灰度值/同一樣品β-actin條帶灰度值）作為統計學分析的原始數據，以去除蛋白不均衡降解造成的誤差。以上檢測均獨立重復3次。

1.2.7MTS法檢測細胞增殖六孔板轉染12 h后收集各組細胞，以每孔1.5×103個細胞接種于96孔板，每組分為轉染后24、48、72和96h，每個時間點設置3個復孔。檢測時每孔加20 μL CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent，37°C，5%CO2環境下孵育2.5 h，用酶標儀以490nm波長測定吸光度值，繪制細胞增殖曲線。

1.3統計學分析

采用SPSS 18.0統計學軟件，所有數據均以x±s表示，采用F檢驗和q檢驗對相應數據行統計學處理，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1miR-29c原位雜交檢測結果

DAPI復染的細胞核經激發后發出藍熒光，miR-29c雜交信號經激發后發出紅熒光。miR-29c陽性細胞的細胞核周圍可見顆粒狀紅色雜交信號，陰性細胞內無雜交信號（圖1）。檢測結果顯示，非腫瘤對照腦組織組及各級別膠質瘤組的細胞均不同程度表達miR-29c，非腫瘤對照腦組織組的miR-29c LI%明顯高于各級別膠質瘤組，不同級別膠質瘤組的miR-29c LI%均隨腫瘤良惡性級別升高而相應降低，4組間miR-29c LI%的差異均有統計學意義（P＜0.001，表1）。

2.2CDC42免疫組織化學檢測結果

CDC42陽性細胞的胞漿呈棕黃色著色，陽性細胞和陰性細胞的細胞核被蘇木素復染成藍色（圖2）。免疫組化檢測結果顯示，CDC42在非腫瘤對照腦組織細胞中低表達，各級別膠質瘤組的細胞均不同程度表達CDC42，且不同級別膠質瘤組的CDC42 LI%均隨腫瘤良惡性級別升高而相應增加，其中，Ⅰ～Ⅱ組與非腫瘤對照腦組織組之間CDC42 LI%的差異無統計學意義，其余各組間差異均有統計學意義（P＜0.001，表1）。

?圖1　非腫瘤對照腦組織及不同級別膠質瘤miR-29c表達的原位雜交檢測結果（×200）Figure 1　In situ hybridization results of miR-29c in nontumoral control brain tissues and gliomas of various pathological grades（×200）

表1　非腫瘤對照組及不同級別膠質瘤組間miR-29c及CDC42 LI%的比較Table 1　Comparison of the LI%of miR-29c and CDC42 among the control and three glioma groups

2.3miR-29c靶mRNA的生物信息學預測結果

生物信息學預測結果顯示，人CDC42 mRNA 3'UTR的全長為1426bp，其3'UTR有3個miR-29c靶序列區，分別位于581～587 bp（靶序列區1）、946～953 bp（靶序列區2）和999 bp-1006 bp（靶序列區3）區間，均有與miR-29c種子序列互補的連續靶序列，前兩個位點為miR-29c的相對保守靶區，第三個位點為miR-29c的高度保守靶區（圖3）。以上結果提示人CDC42 mRNA是miR-29c的潛在靶mRNA。

2.4膠質瘤細胞miR-29c轉染效率的檢測

Hairpin-it miRNA實時定量PCR結果顯示，轉染miR-29c mimics 48h后，miR-29c轉染組細胞miR-29c的相對含量顯著高于U87MG空白對照組和Scr轉染組，差異均有統計學意義（F=83.62，P＜0.001）。說明本研究建立的轉染方法能有效的將miR-29c mimics導入人膠質瘤細胞。

2.5miR-29c對膠質瘤細胞CDC42表達的調控作用

實時定量qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，miR-29c mimics轉染組U87MG細胞的CDC42 mRNA（F=36.60，P＜0.001，圖4A）和蛋白（F=14.26，P= 0.005，圖4B）相對表達量均明顯低于U87MG空白對照組及Scr轉染組，差異均有統計學意義。說明在膠質瘤細胞內，作為CDC42表達的關鍵負調控因子，miR-29c可通過有效誘導CDC42 mRNA降解在轉錄后水平抑制CDC42蛋白表達。

2.6miR-29c對U87MG細胞增殖的影響

MTS增殖曲線反映了各個時間點各組細胞的增殖情況，miR-29c mimics轉染組細胞的增殖活性在48h（F=10.45，P=0.01）、72h（F=8.08，P=0.02）和96h （F=82.89，P＜0.001）均明顯低于U87MG空白對照組及Scr轉染組，差異有統計學意義（圖5）。說明上調miR-29c可明顯抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖活性。

?圖2　非腫瘤對照腦組織及不同級別膠質瘤CDC42表達的免疫組織化學檢測結果（IHC×200）Figure 2　Immunohistochemistry results of CDC42 in nontumoral control brain tissues and gliomas of various pathological grades（IHC×200）

圖3　CDC42 mRNA 3'UTR中miR-29c作用靶點的預測Figure 3　Predicted targets of miR-29c in CDC42 mRNA 3'UTR

圖4　U87MG和Scr對照組及miR-29c mimics轉染組CDC42 mRNA和蛋白相對表達量的比較Figure 4　Comparison of the relative expression levels of CDC42 mRNA and protein among the U87MG，Scr，and miR-29c groups

圖5　上調miR-29c對U87MG細胞增殖的影響Figure 5　Effect of miR-29c upregulation on U87MG cell proliferation

3　討論

膠質瘤是最常見的顱內原發性腫瘤，目前根據良惡性程度將其分為WHOⅠ～Ⅳ級4個不同級別。臨床隨訪發現，即使是相同級別的膠質瘤其預后亦有較大差異。越來越多的證據表明，分子病理學診斷可為評價膠質瘤的良惡性程度、預測預后、輔助臨床制定個體化治療方案提供更為詳盡、可靠的依據［9-10］。近來研究發現，miRNA可作為高效特異性的分子診斷標志物。TS-miRNAs表達異常減少是導致惡性腫瘤的發生、發展的重要因素。miR-29c是一種重要的TS-miRNA，諸多研究發現其在白血病、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多種顱外惡性腫瘤中表達異常減少，并與腫瘤的發生、發展密切相關［3］。本研究結果顯示，不同級別膠質瘤miR-29c表達水平均低于非腫瘤對照腦組織，提示其表達異常減少很可能是導致膠質瘤發生、發展的關鍵分子事件；另外，miR-29c表達水平隨膠質瘤級別升高而相應降低，提示其表達異常減少很可能參與了膠質瘤的惡性進展進程。miR-29c表達水平可作為評價膠質瘤良惡性級別的重要參考指標。

CDC42是具有GTP酶活性的小G蛋白家族成員，在細胞信號通路中具有分子開關的作用，通過調節多種細胞信號轉導，參與細胞增殖、凋亡等過程的調控［4］。研究表明，p21激活激酶（p21-activated kinases，PAKs）是目前研究得最為清楚的CDC42下游效應分子，通過激活AKT、Raf-MAPK等信號通路在細胞增殖、凋亡等方面具有重要的調控作用［11］。本研究應用免疫組織化學法檢測顯示，各級別膠質瘤組CDC42表達水平均高于非腫瘤對照腦組織組，且不同級別膠質瘤組的CDC42 LI%隨腫瘤良惡性級別升高而相應增加。利用生物信息學預測顯示CDC42 mRNA是miR-29c的靶mRNA。應用實時定量qRT-PCR和Westren blot檢測結果顯示，miR-29c轉染組的CDC42 mRNA和蛋白表達水平明顯低于U87MG空白對照組和Scr轉染對照組，進一步證實了在膠質瘤細胞中CDC42 mRNA是miR-29c的靶mRNA。結合miR-29c在各級別膠質瘤中表達情況，進一步證實miR-29c可通過降解CDC42 mRNA抑制其蛋白的表達，從而間接參與CDC42對細胞增殖、凋亡等生物學過程的調控。

研究顯示，miR-29c表達異常減少與多種顱外惡性腫瘤細胞的過度增殖有關［3］，而CDC42在細胞增殖、凋亡等細胞信號通路中具有分子開關的作用。本研究證實CDC42是miR-29c的靶基因，miR-29c表達異常減少導致的CDC42過表達是膠質瘤細胞無限增殖的重要分子機制。miR-29c和CDC42表達水平隨膠質瘤級別升高而進行性降低和升高也是導致高級別膠質瘤增殖高度活躍的重要原因。

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（2014-10-29收稿）

（2014-12-15修回）

（編輯：鄭莉）

石翠娟專業方向為神經病理學。E-mail：scjuan148@163.com

Effects of miR-29c downregulation on glioma cell proliferation

Cuijuan SHI,Ying WANG,Shizhu YU,Cuiyun SUN,Qian WANG,Hui XU,Tongling AN,Yanjun WEN,Jinling XU,Jing LIU, Huining LI

Objective:To investigate microRNA-29c(miR-29c)expression and its relationship with CDC42 in gliomas,as well as to observe its effects on the proliferation of the U87MG glioma cell line.Methods:The expression levels of miR-29c and CDC42 were determined by using locked-oligonucleotide-probe in situ hybridization and immunohistochemistry in 10 cases with nontumor control brain tissues and 60 patients with gliomas of 4 pathological grades.Mature mimics of miR-29c and scrambled sequences were chemically synthesized and then transiently transfected into the U87MG glioma cell line.The miR-29c expression level was quantified by using stem-loop real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(qRT-PCR).The expression levels of CDC42 mRNA and protein,as well as the proliferation capabilities of U87MG,were evaluated by qRT-PCR,Western blot,and MTS assay. Results:Locked-oligonucleotide-probe in situ hybridization showed a downregulation of miR-29c in all glioma samples compared with subjects having nontumor control brain tissues;a continuous decrease was observed as the malignant grade of the tumors increased(P<0.001).CDC42 immunohistochemistry exhibited the opposite pattern.The Labeling index(LI%)value of CDC42 was the highest in the WHO grade IV group.All between-group differences,except for that between the WHO grade I-II and nontumor control groups,were statistically significant(P<0.001).The miR-29c expression levels in miR-29c transcription groups were significantly higher than those in the blank and Scr control groups(P<0.001).Compared with the values for the control groups,the CDC42 mRNA(P<0.001)and protein(P<0.01)levels were significantly decreased in the miR-29c transcription groups.The proliferation capabilities of the U87MG glioma cell line in miR-29c transcription groups were significantly lower than those of the control groups at 48(P<0.05),72(P<0.05), and 96 h(P<0.001)after transient miR-29c transfection.Conclusion:miR-29c is an important tumor-suppressive miRNA that could be used as an important marker to assess the malignant degree of gliomas.The aberrant decrease in miR-29c expression in gliomas resulted in CDC42 upregulation and facilitated glioma cell immortalization.These findings further confirm that miR-29c downregulation may be a key mechanism for glioblastoma tumorigenesis.

glioma,microRNA-29c,cell division cycle 42,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.20141817

天津醫科大學總醫院，天津市神經病學研究所，教育部中樞神經創傷修復與再生重點實驗室，天津市神經損傷變異與再生重點實驗室（天津市300052）

*本文課題受國家“973計劃”分項目（編號：2010CB529405）、國家自然科學基金項目（編號：81202102，81402050）、天津市抗癌重大科技專項項目（編號：12ZCDZSY17400）、天津市應用基礎及前沿技術研究計劃項目（編號：13JCQNJC12100）、天津市高等學校科技發展基金項目（編號：2004ZD06，20110102）、中國神經腫瘤專業委員會科研項目（編號：CSNO-2013-MSD010）、天津醫科大學青年基金項目（編號：2013KYQ02）資助

于士柱tjyushizhu@yahoo.com