接合轉移技術將外源DNA大片段引入變鉛青鏈霉菌中的研究

戴世鯤　周丹燕　王廣華等

摘要：為了發展一種將150 kb及以上的外源DNA片段引入變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）中的有效方法，以大腸桿菌-變鉛青鏈霉菌穿梭細菌人工染色體為載體，將攜帶完整格爾德霉素生物合成基因簇的3個150～180 kb的外源DNA片段期望以接合轉移的方式從大腸桿菌宿主菌（Escherichia coli ET12567/pUZ8002）中橫向轉移入變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）TK23菌株中。結果表明，接合轉移技術能夠有效地將攜帶完整格爾德霉素生物合成基因簇的3個外源DNA大片段引入到變鉛青鏈霉菌基因組中并穩定傳代。

關鍵詞：接合轉移技術；外源DNA大片段；細菌人工染色體；變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）

中圖分類號：R318 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3776-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.051

Abstract： In order to develop an efficient method of transferring 150 kb and above foreign DNA fragments into Streptomyces lividans， intergeneric conjugation technology was utilized to transfer three 150～180 kb foreign DNA fragments， carrying whole geldanamycin biosynthesis gene cluster， into S. lividans TK23 genome， with bacterial artificial chromosome （BAC） of Escherichia coli ET12567/pUZ8002-S. lividans TK23 as vectors. The result showed that all the three foreign DNA fragments were efficiently transferred into S. lividans TK23， and were steadily inherited.

Key words： intergeneric conjugation technology； big foreign DNA fragments； bacterial artificial chromosomes （BAC）； Streptomyces lividans

放線菌是一類革蘭氏陽性菌，能夠產生豐富的具有生物學活性的次級代謝產物和新穎的抗生素。這些天然產物通常是由大片段生物合成基因簇合成的，例如聚酮合成酶（Polyketide synthase，PKS）和非核糖體多肽合成酶（Nonribosomal peptide synthase，NRPS）。為了分析和操作這些完整的生物合成途徑，異源表達是一個重要的手段，特別是對于那些沉默的基因簇和天然產物生物合成的基因簇的研究[1]。然而，部分已經報道的生物合成基因簇都已超過100 kb，例如rapamycin生物合成基因簇是107 kb[2]、daptomycin生物合成基因簇是128 kb[3]。對這些生物合成基因簇進行異源表達的遺傳操作中，將大片段DNA引入宿主菌鏈霉菌中是其中的關鍵步驟。一種策略是將生物合成基因簇分配到幾個兼容的質粒中，在異源宿主中通過共表達實現抗生素的生物合成過程[4]。Zirkle等[5]將soraphen A基因簇分配到2個兼容的質粒中，共轉化變鉛青鏈霉菌（Streptomyce lividans）原生質體，共表達生物合成化合物。另一種策略是使用細菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome， BAC）載體攜帶完整的抗生素生物合成基因簇。Penn等[3]首次利用原生質體轉化的方法將含有完整的daptomycin生物合成基因簇的BAC質粒成功引入變鉛青鏈霉菌中。在放線菌類群中，變鉛青鏈霉菌是異源表達的重要菌種[6，7]。在本研究中，首次利用接合轉移技術成功地將3個150～180 kb的外源DNA片段引入到變鉛青鏈霉菌中，并得到了穩定傳代。這為大片段的生物合成基因簇在變鉛青鏈霉菌中進行異元表達研究和大范圍改造鏈霉菌基因組提供了一種有效的技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、質粒以及生長條件和培養基：大腸桿菌（Escherichia coli）使用Luria-Bertani（LB）固體和液體培養基，添加的抗生素濃度為阿伯拉霉素（Apramycin）50 μg/mL、卡那霉素（Kanamycin）25 μg/mL、氯霉素（Chloramphenicol）12.5 μg/mL。大腸桿菌ET12567/pUZ8002菌株作為變鉛青鏈霉菌TK23菌株接合轉移的供體菌。變鉛青鏈霉菌菌株以MS為固體培養基，在28 ℃培養。載體pBAC-1003是一個16 kb的大腸桿菌和變鉛青鏈霉菌的穿梭BAC載體，組成元件包括φC31 int、attP、oriT和阿伯拉霉素抗性基因[aac（3）Ⅳ]。3個BAC質粒pH4E9、pH19H10和pH22H5分別以pBAC-1003為載體，插入片段覆蓋完整的格爾德霉素（Geldanamycin）生物合成基因簇，脈沖場凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）顯示插入片段分布為150～180 kb（圖1）。2×YT培養基（1 L培養基加16 g Difco Bacto tryptone，10 g Difco Bacto yeast extract，5 g NaCl），AS-1培養基（1 L培養基加1 g yeast extract，0.2 g L-alanine，0.2 g L-arginine， 0.5 g L-asparagine，5 g soluble starch，2.5 g NaCl，10 g Na2SO，20 g agar， pH 7.5）和MS（Mannitol soya flour）培養基（1 L培養基加20 g mannitol，20 g soya flour，20 g agar）用于準備變鉛青鏈霉菌孢子和接合轉移培養基。

1.2 大片段BAC質粒的接合轉移

質粒pBAC-1003、pH4E9、pH19H10和pH22H5分別被電轉化至大腸桿菌ET12567/pUZ8002菌株中。與變鉛青鏈霉菌TK23菌株的接合轉移根據標準方法[8]稍作修改，具體步驟：①供體菌大腸桿菌ET12567/pUZ8002菌株接種于LB培養基，在37 ℃搖床中培養至OD600為0.4～0.6。②離心收集細胞，用等體積的LB液體培養基洗2次，最后懸浮于0.1倍體積的LB培養基中。③從MS平板上刮取收集變鉛青鏈霉菌孢子，并懸浮于2×YT培養基中，制成濃度為108個孢子/500 μL的孢子懸液，50 ℃熱激10 min預萌發。④將500 μL大腸桿菌供體菌懸液加入準備好的500 μL孢子液中，混合物涂布在AS-1培養基平板上，平板中添加MgCl2至終濃度為10 mmol/L。⑤平板28 ℃培養16～20 h后，每個平板的表面覆蓋含有0.5 mg萘啶酮酸（Nalidixic acid）、1 mg阿伯拉霉素和1 mL水的混合物。平板在28 ℃繼續培養6 d。⑥將平板上長出的菌落（疑是陽性接合子）在MS培養基平板上劃線轉接，培養基中添加25 μg/mL萘啶酮酸和50 μg/mL阿伯拉霉素。

1.3 變鉛青鏈霉菌TK23陽性接合子的PCR驗證

采用PCR方法驗證陽性接合子基因組中的外源DNA片段，即攜帶格爾德霉素生物合成基因簇的BAC質粒。在添加阿伯拉霉素和萘啶酮酸的MS平板上劃線培養3代之后，提取陽性接合子基因組DNA。3對特異性引物用于聯合檢測陽性接合子，其中兩對為格爾德霉素基因簇的特異性引物，擴增區域分別是格爾德霉素生物合成基因簇的聚酮合成酶（PKS）第一個酮基合成酶（KS）域GdmKS1基因（forward：5′-GGTGTCGGGTTGGTGTTGCTG-3′， reverse：5′-GCTGACGCCGAAGGAGGAGATT-3′）和后修飾區域的GdmRI基因（forward：5′-GCTGACCGTGATGTAGAGGC-3′，reverse：5′-AGCGGTATCTGTGCTTCCTG-3′），這兩個基因分別位于格爾德霉素基因簇前端和末端[9]；第三對引物為阿伯拉霉素抗性基因的特異性引物Apr（Apr_1：5′-CAGTTGACCCAGGGCTGTC-3′，Apr_2：5′-GCAATACGAATGGCGAAAA-3′）。PCR反應采用Ex Taq聚合酶（TaKaRa），陽性接合子的基因組DNA作為模板。PCR反應程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物TA克隆至pMD18-T載體中，進一步測序驗證。

2 結果與分析

2.1 變鉛青鏈霉菌TK23菌株陽性接合子的驗證

以格爾德霉素原始產生菌的基因組DNA作為陽性對照，變鉛青鏈霉菌TK23受體菌的基因組DNA作為陰性對照。3個BAC質粒的變鉛青鏈霉菌TK23陽性接合子基因組DNA使用GdmKS1基因和GdmRI基因的兩對引物進行PCR擴增均能得到目標條帶（圖2），測序結果證實序列正確。同時阿伯拉霉素抗性基因的特異性引物Apr對陽性接合子的PCR擴增條帶和測序結果均正確（圖3）。3對聯合檢測的特異性引物的PCR結果表明接合轉移試驗是成功的。

2.2 大片段BAC質粒的接合轉移效率

3個BAC質粒通過接合轉移進入變鉛青鏈霉菌TK23受體菌后，BAC質粒在int基因的表達產物整合酶的作用下整合到受體菌基因組中。大片段BAC質粒的接合轉移效率（陽性接合子數除以變鉛青鏈霉菌受體菌孢子數）對于插入片段的長度具有一定的敏感性。3個插入片段為150～180 kb的BAC質粒與空載BAC質粒相比，接合轉移的效率明顯降低（圖4），空載BAC質粒的接合轉移效率為1.1×10-3，3個BAC質粒pH4E9、pH19H10和pH22H5的接合轉移效率分別為2.5×10-6、3.8×10-6和7.3×10-7，比空載BAC質粒的接合轉移效率低103個數量級。BAC質粒pH22H5的插入片段最大（約180 kb），因而其接合轉移效率也是最低的。

3 討論

原生質體轉化是經典的鏈霉菌基因轉移方法，但是原生質體轉化的試驗操作復雜，包括原生質體的制備和轉化后細胞的再生，外源DNA易受到原生質體制備過程中產生的胞外核酸酶的作用而降解，整個試驗過程難以控制。與原生質體轉化相比，接合轉移的試驗過程較簡單，可避開胞外核酸酶的降解作用，同時還可克服鏈霉菌對外源DNA的限制性障礙，目前已在多個種屬的鏈霉菌中成功使用。

接合轉移供體菌常選擇大腸桿菌ET12567菌株，它是一種甲基化缺陷型菌株，可有效地避免一些鏈霉菌種屬中甲基化修飾限制系統的作用。接合轉移的質粒載體一般為大腸桿菌和鏈霉菌的穿梭載體。在接合轉移過程中，穿梭載體在pUZ8002的輔助下進入鏈霉菌菌株中。外源DNA在穿梭載體上int基因表達的產物整合酶作用下，載體中的attP序列與鏈霉菌基因組中的attB序列發生特異性重組，將穿梭載體及其攜帶的外源DNA整合到鏈霉菌基因組中。

目前，接合轉移技術常用于鏈霉菌的基因敲除和基因回補[10]，多是10 kb以下短片段，用于cosmid載體也有報道，但大片段BAC質粒則少有報道。本研究首次利用接合轉移技術將3個150～180 Kb的外源DNA片段引入變鉛青鏈霉菌中，這一方法擴展了在鏈霉菌異源宿主中運送大片段外源DNA的遺傳操作技術，有助于對鏈霉菌代謝工程和合成生物學的研究。這項研究結果暗示在自然環境中微生物菌株間的大片段DNA橫向轉移具有一定的可能性，而這種可能性是抗生素生物合成途徑進化理論的假說之一。

參考文獻：

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