高劑量60Co—γ射線輻照對紫花苜蓿種子的誘變及致死效應伏

陳浩等

摘要：利用高劑量60Co-γ射線輻照處理紫花苜蓿（Medicago sativa L.）干種子，比較研究不同輻照劑量（1.45、3.75、5.98、7.96、11.90 kGy）對種子發芽率、幼苗長度、形態的影響。結果表明，高劑量γ射線輻照可以抑制紫花苜蓿種子的萌發，隨著輻照劑量的增加，種子發芽率顯著降低，當輻照劑量達到11.90 kGy時，種子發芽率為0，導致種子失活。隨著輻照劑量的增加，發芽幼苗長度顯著降低，1.45 kGy照射種子，萌發96 h后，其長度僅為對照的55.00%，7.96 kGy處理種子的長度只有對照的22.78%。說明高劑量輻照對種子的誘變致畸效果顯著增加。

關鍵詞：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）；60Co-γ射線；發芽；種子；誘變育種

中圖分類號： S542 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3708-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.033

Abstract： Seeds of Medicago sativa L. were irradiated by 1.45，3.75，5.98，7.96，11.90 kGy 60Co-γ rays， the germination percentage，seedling length were studied in different dose treatment. The results showed that high dose irradiation inhibited seed germination，with the dose increased，the germination percentage significantly decreased，the seeds dead by 11.9 kGy 60Co-γ rays irradiation.With the increase of radiation dose，seedling length significantly reduced， after 96 h incubated，the 1.45 kGy dose treated seedling length just 55.00% of control，7.96 kGy dose treated seedling length just 22.78% of control，indicated that high dose irradiation on Medicago seed caused the mutation effects increasing significantly.

Key words： Medicago sativa L.；60Co-γ rays；germination；seed；mutation breeding

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）屬豆科蝶形花亞科苜蓿屬一年生或多年生宿根性草本植物[1]。紫花苜蓿素有“牧草之王”的稱號，是世界上最重要、最有價值的栽培牧草，在全世界范圍內廣泛種植。美國是世界上紫花苜蓿種植面積最大的國家，種植總面積超過了1 000萬hm2，約占世界總種植面積的33%；中國居第五位，約占世界種植總面積的4.5%，分布于全國14個省區[1，2]。紫花苜蓿的適應性強，產量高，且品質好，營養價值高，含有豐富的蛋白質、礦物質和維生素等重要的營養成分，而且還含有氨基酸、微量元素及未知生長因子，可作為很好的精飼料替代品。紫花苜蓿適口性好，家畜都比較喜食，易消化。紫花苜蓿對土壤要求不高，喜中性或微堿性土壤（pH﹤8），但不耐強酸或強堿性土壤；紫花苜蓿的根系發達，能吸收到土壤深層的水分和養分，還可減少地表徑流，起到保持水土的作用[3，4]。

中國的苜蓿產業化起步比較晚，但近年來發展比較快。隨著中國的西部大開發和退耕還林還草工作的深入，農牧產業結構調整，畜牧業得到迅猛發展，紫花苜蓿的種植范圍隨之不斷擴大。紫花苜蓿的種植已不僅僅局限于北方地區，近年來南方也進行了引種，并且也有新品種培育成功，在南方地區得到了初步試驗推廣。但是，想要紫花苜蓿產業在南方地區得到長足的發展，在這樣的形勢之下，亟待解決的就是紫花苜蓿與南方環境的矛盾問題。解決這一矛盾的根本辦法就是選育出適宜本地地理環境和氣候條件的優良品種，人工誘變法獲得優良品種的種質資源是較快捷的方法之一。

60Co-γ射線輻照是最為有效的人工誘變育種方法之一，已經在農作物育種中得到廣泛應用[5]。利用60Co-γ射線輻照人工誘變育種紫花苜蓿的研究相對較少，本研究探討不同60Co-γ射線輻照劑量對紫花苜蓿種子發芽率、生長情況、根尖細胞活性氧代謝的影響，為紫花苜蓿的人工誘變育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紫花苜蓿（威納爾）為供試材料。

1.2 試驗處理

利用四川省原子能研究院60Co-γ射線輻射源對紫花苜蓿種子進行輻照處理，共設置1個對照組和5個照射處理組，各組的設計照射劑量為1、3、5、8、10 kGy，照射過程通過吸收劑量監測，實際測得各組的吸收劑量分別為1.45、3.75、5.98、7.96、11.90 kGy。

經過照射后的種子用蒸餾水沖洗，除去雜質和干癟的種子，再用蒸餾水清洗3遍，備用。將兩層定性濾紙平鋪于直徑為9 cm的培養皿中，加入5 mL的蒸餾水作為發芽床，放置紫花苜蓿種子，每個培養皿中放入35粒種子，每個處理設置3個平行。開始培養時間記作第0小時，于第48小時再加入5 mL蒸餾水。所有種子均在光照培養箱中培養，前60 h完全避光培養，從第61小時開始光照（光照∶黑暗12 h∶12 h）進行培養，培養溫度為28 ℃。每隔24 h觀察記錄種子的發芽率，第96小時對已發芽種子進行收集，測定其長度，觀察根尖形態特征。

1.3 根尖NBT染色

NBT （P-nitroblue tetrazolium）能夠和超氧陰離子（O2·-）反應形成甲瓚呈藍紫色，根部產生的O2·-與NBT反應后形成的顏色深淺能反映O2·-產生的多少。分別取各處理萌發種子10株，按照Dunand等[6]的方法進行NBT染色，然后用體視顯微鏡觀察根尖形態特征并拍照。

1.4 數據處理

數據用平均值±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 不同輻照劑量對紫花苜蓿種子發芽率的影響

經過γ射線輻照處理后，紫花苜蓿種子的發芽率總體上呈現下降的趨勢（圖1，圖2）。種子經培養24 h后，經過輻照處理的紫花苜蓿種子發芽率均顯著低于對照，且輻照劑量大于5.98 kGy照射的種子基本上沒有發芽（圖1）。培養48 h后，1.45 kGy和3.75 kGy輻照種子的發芽率略高于對照，但是差異不顯著（P﹥0.05），5.98 kGy和7.96 kGy照射種子的發芽率分別達到55.24%和33.33%，極顯著低于對照水平（P﹤0.01）；發芽72 h和96 h后1.45 kGy輻照種子的發芽率略高于對照，但是差異不顯著（P>0.05），3.75 kGy輻照種子的發芽率與對照持平，輻照劑量大于5.98 kGy照射的種子發芽率低于對照水平，但是差異在逐漸縮小（圖1）。整個試驗過程中，輻照劑量為11.90 kGy的紫花苜蓿種子始終未發芽（圖2）。

2.2 不同輻照劑量對紫花苜蓿種子發芽幼苗長度的影響

由圖3可知，經過96 h發芽后，各劑量輻照處理的紫花苜蓿發芽種子長度隨著輻照劑量的增加逐漸降低，降低的幅度與對照相比差異極顯著（P﹤0.01）。1.45 kGy處理種子的長度已經顯著降低，為對照的55%。7.96 kGy處理種子的長度只有對照的22.78%。11.90 kGy輻照的種子沒有發芽，因此其長度記為0，圖中未顯示，說明11.90 kGy劑量照射紫花苜蓿種子已經導致種子失活，該劑量為紫花苜蓿種子的致死劑量。

2.3 不同輻照劑量對紫花苜蓿種子發芽幼苗形態的影響

由圖4可知，經過輻照處理的種子發芽后，幼苗的長度顯著低于對照的水平，圖3中統計結果一致。輻照后的幼苗根芽長都顯著降低，其根部變得短粗，根部生長不規則程度增加。經過輻照后的種子幼苗根分生區顯著變短，說明該部位細胞生長受到嚴重的抑制，導致植株長度變短。7.96 kGy輻照的種子萌發后，子葉明顯變黃，并且部分子葉上出現了黃色條紋，說明高劑量的輻照處理，對其損傷比較嚴重。

活性氧是細胞代謝的次生副產物，包括超氧陰離子（O2·-）、羥自由基（OH·）、過氧化氫（H2O2）等，近年來的研究證明，活性氧參與調控根尖細胞的生長[7，8]。為了進一步驗證，輻照對萌發種子的損傷，對其根尖超氧陰離子（O2·-）的產生進行NBT原位染色觀察。由圖5可知，對照根尖分生區細胞活性氧產生較多，分生區較長，而經過不同劑量輻照的種子，萌發后的根尖分生區明顯比對照短，隨著輻照劑量的增加，根尖分生區長度呈現遞減的趨勢，尤其是經過7.96 kGy輻照的種子，萌發后的根尖分生區基本上觀察不到與對照一樣紫得發黑的區域，說明細胞生長嚴重受阻。另外，從圖中還可看到，對照組根部表面光滑，形態均勻，而輻照處理各組的根部表面凹凸不平，形態不規則，隨著輻照劑量的增加不規則程度也越發嚴重。

3 討論

3.1 高劑量輻照對紫花苜蓿種子的誘變及致死效應

不同植物甚至同種植物的不同品種間對60Co-γ射線輻照的敏感性都有較大的差別[9，10]，經過前期的試驗發現，低劑量照射對紫花苜蓿（威納爾）種子萌發的影響不明顯，因此采用高劑量60Co-γ射線輻照紫花苜蓿種子，觀察不同60Co-γ射線輻照劑量對紫花苜蓿種子萌發的影響。試驗結果證明，高劑量輻照能夠引起紫花苜蓿種子發芽率降低，生長長度降低，說明高劑量輻照使紫花苜蓿種子的生物活性降低。其中，經11.90 kGy輻照處理的種子，全部沒有發芽，說明該劑量照射導致種子全部失活，種子死亡，11.90 kGy是紫花苜蓿種子的致死劑量。紫花苜蓿種子的發芽率在24 h時隨著輻照劑量的增加而降低，且經5.98、7.96 kGy輻照的種子均未發芽（圖1），但隨著發芽時間的增加，各處理組發芽率逐漸增加，并且與對照組的差距逐漸縮小，而且1.45 kGy輻照種子的發芽率在萌發48 h后均高于對照，說明高劑量輻照種子的萌發具有滯后性。

近年來的研究表明，活性氧在植物生長發育過程中扮演著重要的角色，Muller等[11]證明活性氧能攻擊細胞壁的多糖，引起細胞壁松動，進而調節植物種子萌發和幼苗生長。NBT染色結果表明，經過輻照種子萌發后，根尖分生區明顯比對照組短，說明受輻照的影響，超氧陰離子產生受到影響，使根尖分生區細胞生長受到顯著抑制。另外，張月學等[12]對高劑量60Co-γ射線輻照紫花苜蓿種子幼苗的根尖細胞進行觀察發現，γ射線輻照苜蓿種子可以抑制根尖細胞有絲分裂，并誘發根尖細胞產生單微核、雙微核、多微核、小核、染色體斷片、染色體黏連、單橋、雙橋、多橋、游離染色體、落后染色體等多種畸變。在0～2 000 Gy范圍內，隨劑量的增加各種畸變率不斷提高，至2 000 Gy輻照劑量時，各種畸變率達到最高。由于γ射線輻照導致紫花苜蓿根尖細胞染色體的變異是抑制種子幼苗生長的原因之一，染色體不能夠進行正常的復制，導致有絲分裂減緩，根尖分生區生長受抑制。

3.2 60Co-γ射線輻照在紫花苜蓿育種中的潛力

采用輻射誘變培育作物新品種，能夠提高植物的變異頻率，擴大變異范圍，縮短育種時間，獲得某些優良性狀。利用60Co-γ射線輻照育種已經取得了一些很好的農作物品種。中國在20世紀60年代開始對果樹進行輻照誘變育種，1963年中國農業科學院柑橘研究所用γ射線照射錦橙的干種子，育成產量高、品質好、少核的418紅橘、中育7號、中育8號[13]。李建黎等[14]利用60Co-γ射線輻照育種，篩選出了綜合性狀較好的大豆新品系。近年來利用60Co-γ射線輻照育種的作物品種不斷擴大，趙興華等[15]以60Co-γ射線輻照處理切花百合“科瓦拉”、“不同凡響”、“雙重驚喜”的鱗莖，開展輻射誘變育種試驗。曾捷等[16]以牧草型‘雅安扁穗牛鞭草（Hemarthria compressa “Yaan”）和草坪型“H055”扁穗牛鞭草（H.compressa “H055”）為材料，研究了60Co-γ射線誘變的適宜照射劑量。

本研究利用高劑量（1～10 kGy）的60Co-γ射線輻照紫花苜蓿的干種子，通過種子萌發情況，觀察高劑量輻照對紫花苜蓿種子萌發的影響。結果顯示，隨著輻照劑量的增加，其發芽率逐漸降低，幼苗長度逐漸降低，說明種子受損傷程度逐漸增加。在輻照育種中，選擇適宜的輻照劑量對于育種來說至關重要，目前一般選擇種子的半致死劑量進行輻照，但是對于半致死劑量的計算方法還沒有統一的標準[17]，從本試驗結果來看，在1.45 kGy輻照劑量條件下，萌發96 h種子的長度約為對照的一半，種子萌發24 h后其發芽率約為對照的一半，且根據包建忠[10]等的試驗結果來看，1 000 Gy輻照種子萌發后，根尖細胞的畸變率已經高于14%，這為紫花苜蓿60Co-γ射線誘變育種提供了參考。

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