高劑量60Co—γ射線輻照對(duì)紫花苜蓿種子的誘變及致死效應(yīng)伏

陳浩等

摘要：利用高劑量60Co-γ射線輻照處理紫花苜蓿（Medicago sativa L.）干種子，比較研究不同輻照劑量（1.45、3.75、5.98、7.96、11.90 kGy）對(duì)種子發(fā)芽率、幼苗長(zhǎng)度、形態(tài)的影響。結(jié)果表明，高劑量γ射線輻照可以抑制紫花苜蓿種子的萌發(fā)，隨著輻照劑量的增加，種子發(fā)芽率顯著降低，當(dāng)輻照劑量達(dá)到11.90 kGy時(shí)，種子發(fā)芽率為0，導(dǎo)致種子失活。隨著輻照劑量的增加，發(fā)芽幼苗長(zhǎng)度顯著降低，1.45 kGy照射種子，萌發(fā)96 h后，其長(zhǎng)度僅為對(duì)照的55.00%，7.96 kGy處理種子的長(zhǎng)度只有對(duì)照的22.78%。說明高劑量輻照對(duì)種子的誘變致畸效果顯著增加。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）；60Co-γ射線；發(fā)芽；種子；誘變育種

中圖分類號(hào)： S542 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）15-3708-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.033

Abstract： Seeds of Medicago sativa L. were irradiated by 1.45，3.75，5.98，7.96，11.90 kGy 60Co-γ rays， the germination percentage，seedling length were studied in different dose treatment. The results showed that high dose irradiation inhibited seed germination，with the dose increased，the germination percentage significantly decreased，the seeds dead by 11.9 kGy 60Co-γ rays irradiation.With the increase of radiation dose，seedling length significantly reduced， after 96 h incubated，the 1.45 kGy dose treated seedling length just 55.00% of control，7.96 kGy dose treated seedling length just 22.78% of control，indicated that high dose irradiation on Medicago seed caused the mutation effects increasing significantly.

Key words： Medicago sativa L.；60Co-γ rays；germination；seed；mutation breeding

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）屬豆科蝶形花亞科苜蓿屬一年生或多年生宿根性草本植物[1]。紫花苜蓿素有“牧草之王”的稱號(hào)，是世界上最重要、最有價(jià)值的栽培牧草，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植。美國是世界上紫花苜蓿種植面積最大的國家，種植總面積超過了1 000萬hm2，約占世界總種植面積的33%；中國居第五位，約占世界種植總面積的4.5%，分布于全國14個(gè)省區(qū)[1，2]。紫花苜蓿的適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高，且品質(zhì)好，營養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等重要的營養(yǎng)成分，而且還含有氨基酸、微量元素及未知生長(zhǎng)因子，可作為很好的精飼料替代品。紫花苜蓿適口性好，家畜都比較喜食，易消化。紫花苜蓿對(duì)土壤要求不高，喜中性或微堿性土壤（pH﹤8），但不耐強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性土壤；紫花苜蓿的根系發(fā)達(dá)，能吸收到土壤深層的水分和養(yǎng)分，還可減少地表徑流，起到保持水土的作用[3，4]。

中國的苜蓿產(chǎn)業(yè)化起步比較晚，但近年來發(fā)展比較快。隨著中國的西部大開發(fā)和退耕還林還草工作的深入，農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，畜牧業(yè)得到迅猛發(fā)展，紫花苜蓿的種植范圍隨之不斷擴(kuò)大。紫花苜蓿的種植已不僅僅局限于北方地區(qū)，近年來南方也進(jìn)行了引種，并且也有新品種培育成功，在南方地區(qū)得到了初步試驗(yàn)推廣。但是，想要紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)在南方地區(qū)得到長(zhǎng)足的發(fā)展，在這樣的形勢(shì)之下，亟待解決的就是紫花苜蓿與南方環(huán)境的矛盾問題。解決這一矛盾的根本辦法就是選育出適宜本地地理環(huán)境和氣候條件的優(yōu)良品種，人工誘變法獲得優(yōu)良品種的種質(zhì)資源是較快捷的方法之一。

60Co-γ射線輻照是最為有效的人工誘變育種方法之一，已經(jīng)在農(nóng)作物育種中得到廣泛應(yīng)用[5]。利用60Co-γ射線輻照人工誘變育種紫花苜蓿的研究相對(duì)較少，本研究探討不同60Co-γ射線輻照劑量對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽率、生長(zhǎng)情況、根尖細(xì)胞活性氧代謝的影響，為紫花苜蓿的人工誘變育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以紫花苜蓿（威納爾）為供試材料。

1.2 試驗(yàn)處理

利用四川省原子能研究院60Co-γ射線輻射源對(duì)紫花苜蓿種子進(jìn)行輻照處理，共設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)照射處理組，各組的設(shè)計(jì)照射劑量為1、3、5、8、10 kGy，照射過程通過吸收劑量監(jiān)測(cè)，實(shí)際測(cè)得各組的吸收劑量分別為1.45、3.75、5.98、7.96、11.90 kGy。

經(jīng)過照射后的種子用蒸餾水沖洗，除去雜質(zhì)和干癟的種子，再用蒸餾水清洗3遍，備用。將兩層定性濾紙平鋪于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，加入5 mL的蒸餾水作為發(fā)芽床，放置紫花苜蓿種子，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入35粒種子，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。開始培養(yǎng)時(shí)間記作第0小時(shí)，于第48小時(shí)再加入5 mL蒸餾水。所有種子均在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，前60 h完全避光培養(yǎng)，從第61小時(shí)開始光照（光照∶黑暗12 h∶12 h）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃。每隔24 h觀察記錄種子的發(fā)芽率，第96小時(shí)對(duì)已發(fā)芽種子進(jìn)行收集，測(cè)定其長(zhǎng)度，觀察根尖形態(tài)特征。

1.3 根尖NBT染色

NBT （P-nitroblue tetrazolium）能夠和超氧陰離子（O2·-）反應(yīng)形成甲瓚呈藍(lán)紫色，根部產(chǎn)生的O2·-與NBT反應(yīng)后形成的顏色深淺能反映O2·-產(chǎn)生的多少。分別取各處理萌發(fā)種子10株，按照Dunand等[6]的方法進(jìn)行NBT染色，然后用體視顯微鏡觀察根尖形態(tài)特征并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻照劑量對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽率的影響

經(jīng)過γ射線輻照處理后，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率總體上呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖1，圖2）。種子經(jīng)培養(yǎng)24 h后，經(jīng)過輻照處理的紫花苜蓿種子發(fā)芽率均顯著低于對(duì)照，且輻照劑量大于5.98 kGy照射的種子基本上沒有發(fā)芽（圖1）。培養(yǎng)48 h后，1.45 kGy和3.75 kGy輻照種子的發(fā)芽率略高于對(duì)照，但是差異不顯著（P﹥0.05），5.98 kGy和7.96 kGy照射種子的發(fā)芽率分別達(dá)到55.24%和33.33%，極顯著低于對(duì)照水平（P﹤0.01）；發(fā)芽72 h和96 h后1.45 kGy輻照種子的發(fā)芽率略高于對(duì)照，但是差異不顯著（P>0.05），3.75 kGy輻照種子的發(fā)芽率與對(duì)照持平，輻照劑量大于5.98 kGy照射的種子發(fā)芽率低于對(duì)照水平，但是差異在逐漸縮小（圖1）。整個(gè)試驗(yàn)過程中，輻照劑量為11.90 kGy的紫花苜蓿種子始終未發(fā)芽（圖2）。

2.2 不同輻照劑量對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽幼苗長(zhǎng)度的影響

由圖3可知，經(jīng)過96 h發(fā)芽后，各劑量輻照處理的紫花苜蓿發(fā)芽種子長(zhǎng)度隨著輻照劑量的增加逐漸降低，降低的幅度與對(duì)照相比差異極顯著（P﹤0.01）。1.45 kGy處理種子的長(zhǎng)度已經(jīng)顯著降低，為對(duì)照的55%。7.96 kGy處理種子的長(zhǎng)度只有對(duì)照的22.78%。11.90 kGy輻照的種子沒有發(fā)芽，因此其長(zhǎng)度記為0，圖中未顯示，說明11.90 kGy劑量照射紫花苜蓿種子已經(jīng)導(dǎo)致種子失活，該劑量為紫花苜蓿種子的致死劑量。

2.3 不同輻照劑量對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽幼苗形態(tài)的影響

由圖4可知，經(jīng)過輻照處理的種子發(fā)芽后，幼苗的長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照的水平，圖3中統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致。輻照后的幼苗根芽長(zhǎng)都顯著降低，其根部變得短粗，根部生長(zhǎng)不規(guī)則程度增加。經(jīng)過輻照后的種子幼苗根分生區(qū)顯著變短，說明該部位細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，導(dǎo)致植株長(zhǎng)度變短。7.96 kGy輻照的種子萌發(fā)后，子葉明顯變黃，并且部分子葉上出現(xiàn)了黃色條紋，說明高劑量的輻照處理，對(duì)其損傷比較嚴(yán)重。

活性氧是細(xì)胞代謝的次生副產(chǎn)物，包括超氧陰離子（O2·-）、羥自由基（OH·）、過氧化氫（H2O2）等，近年來的研究證明，活性氧參與調(diào)控根尖細(xì)胞的生長(zhǎng)[7，8]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，輻照對(duì)萌發(fā)種子的損傷，對(duì)其根尖超氧陰離子（O2·-）的產(chǎn)生進(jìn)行NBT原位染色觀察。由圖5可知，對(duì)照根尖分生區(qū)細(xì)胞活性氧產(chǎn)生較多，分生區(qū)較長(zhǎng)，而經(jīng)過不同劑量輻照的種子，萌發(fā)后的根尖分生區(qū)明顯比對(duì)照短，隨著輻照劑量的增加，根尖分生區(qū)長(zhǎng)度呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)，尤其是經(jīng)過7.96 kGy輻照的種子，萌發(fā)后的根尖分生區(qū)基本上觀察不到與對(duì)照一樣紫得發(fā)黑的區(qū)域，說明細(xì)胞生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻。另外，從圖中還可看到，對(duì)照組根部表面光滑，形態(tài)均勻，而輻照處理各組的根部表面凹凸不平，形態(tài)不規(guī)則，隨著輻照劑量的增加不規(guī)則程度也越發(fā)嚴(yán)重。

3 討論

3.1 高劑量輻照對(duì)紫花苜蓿種子的誘變及致死效應(yīng)

不同植物甚至同種植物的不同品種間對(duì)60Co-γ射線輻照的敏感性都有較大的差別[9，10]，經(jīng)過前期的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低劑量照射對(duì)紫花苜蓿（威納爾）種子萌發(fā)的影響不明顯，因此采用高劑量60Co-γ射線輻照紫花苜蓿種子，觀察不同60Co-γ射線輻照劑量對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響。試驗(yàn)結(jié)果證明，高劑量輻照能夠引起紫花苜蓿種子發(fā)芽率降低，生長(zhǎng)長(zhǎng)度降低，說明高劑量輻照使紫花苜蓿種子的生物活性降低。其中，經(jīng)11.90 kGy輻照處理的種子，全部沒有發(fā)芽，說明該劑量照射導(dǎo)致種子全部失活，種子死亡，11.90 kGy是紫花苜蓿種子的致死劑量。紫花苜蓿種子的發(fā)芽率在24 h時(shí)隨著輻照劑量的增加而降低，且經(jīng)5.98、7.96 kGy輻照的種子均未發(fā)芽（圖1），但隨著發(fā)芽時(shí)間的增加，各處理組發(fā)芽率逐漸增加，并且與對(duì)照組的差距逐漸縮小，而且1.45 kGy輻照種子的發(fā)芽率在萌發(fā)48 h后均高于對(duì)照，說明高劑量輻照種子的萌發(fā)具有滯后性。

近年來的研究表明，活性氧在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演著重要的角色，Muller等[11]證明活性氧能攻擊細(xì)胞壁的多糖，引起細(xì)胞壁松動(dòng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。NBT染色結(jié)果表明，經(jīng)過輻照種子萌發(fā)后，根尖分生區(qū)明顯比對(duì)照組短，說明受輻照的影響，超氧陰離子產(chǎn)生受到影響，使根尖分生區(qū)細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制。另外，張?jiān)聦W(xué)等[12]對(duì)高劑量60Co-γ射線輻照紫花苜蓿種子幼苗的根尖細(xì)胞進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，γ射線輻照苜蓿種子可以抑制根尖細(xì)胞有絲分裂，并誘發(fā)根尖細(xì)胞產(chǎn)生單微核、雙微核、多微核、小核、染色體斷片、染色體黏連、單橋、雙橋、多橋、游離染色體、落后染色體等多種畸變。在0～2 000 Gy范圍內(nèi)，隨劑量的增加各種畸變率不斷提高，至2 000 Gy輻照劑量時(shí)，各種畸變率達(dá)到最高。由于γ射線輻照導(dǎo)致紫花苜蓿根尖細(xì)胞染色體的變異是抑制種子幼苗生長(zhǎng)的原因之一，染色體不能夠進(jìn)行正常的復(fù)制，導(dǎo)致有絲分裂減緩，根尖分生區(qū)生長(zhǎng)受抑制。

3.2 60Co-γ射線輻照在紫花苜蓿育種中的潛力

采用輻射誘變培育作物新品種，能夠提高植物的變異頻率，擴(kuò)大變異范圍，縮短育種時(shí)間，獲得某些優(yōu)良性狀。利用60Co-γ射線輻照育種已經(jīng)取得了一些很好的農(nóng)作物品種。中國在20世紀(jì)60年代開始對(duì)果樹進(jìn)行輻照誘變育種，1963年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所用γ射線照射錦橙的干種子，育成產(chǎn)量高、品質(zhì)好、少核的418紅橘、中育7號(hào)、中育8號(hào)[13]。李建黎等[14]利用60Co-γ射線輻照育種，篩選出了綜合性狀較好的大豆新品系。近年來利用60Co-γ射線輻照育種的作物品種不斷擴(kuò)大，趙興華等[15]以60Co-γ射線輻照處理切花百合“科瓦拉”、“不同凡響”、“雙重驚喜”的鱗莖，開展輻射誘變育種試驗(yàn)。曾捷等[16]以牧草型‘雅安扁穗牛鞭草（Hemarthria compressa “Yaan”）和草坪型“H055”扁穗牛鞭草（H.compressa “H055”）為材料，研究了60Co-γ射線誘變的適宜照射劑量。

本研究利用高劑量（1～10 kGy）的60Co-γ射線輻照紫花苜蓿的干種子，通過種子萌發(fā)情況，觀察高劑量輻照對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響。結(jié)果顯示，隨著輻照劑量的增加，其發(fā)芽率逐漸降低，幼苗長(zhǎng)度逐漸降低，說明種子受損傷程度逐漸增加。在輻照育種中，選擇適宜的輻照劑量對(duì)于育種來說至關(guān)重要，目前一般選擇種子的半致死劑量進(jìn)行輻照，但是對(duì)于半致死劑量的計(jì)算方法還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[17]，從本試驗(yàn)結(jié)果來看，在1.45 kGy輻照劑量條件下，萌發(fā)96 h種子的長(zhǎng)度約為對(duì)照的一半，種子萌發(fā)24 h后其發(fā)芽率約為對(duì)照的一半，且根據(jù)包建忠[10]等的試驗(yàn)結(jié)果來看，1 000 Gy輻照種子萌發(fā)后，根尖細(xì)胞的畸變率已經(jīng)高于14%，這為紫花苜蓿60Co-γ射線誘變育種提供了參考。

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