關于“單克隆抗體”中相關問題的探討

陳顏

“單克隆抗體”是高中生物選修教材中“動物細胞工程”中的重點和難點，同時又是高考的必考內容。由于學生對免疫的相關知識欠缺，造成學生對這項現代生物技術即充滿好奇又難以理解，做題時無從下手，錯誤百出。因而學生要達到課標要求的理解、綜合應用水平，還需要教師對教材的內容加以拓展和加深，以幫助學生正確理解單克隆抗體的內涵，從而應對各類復雜的問題。

現就學習過程中，學生難以理解的知識點加以分析總結，以幫助學生正確理解相關知識。

1 傳統制備抗體的缺點及理解

長期以來，人們為了獲得抗體，傳統的方法是向動物體內反復注射某種抗原，使動物產生抗體，然后從動物的血清中分離所需的抗體。這種方法不僅產量低，純度低，而且制備的抗體特異性差。采用傳統方法制備的抗體為什么產量低，純度低，而且特異性差？

由于一種抗原可含有多個抗原決定簇，這種抗原決定簇可以隱藏在抗原內部，也可以暴露在抗原表面。因此當一種抗原注射到人或哺乳動物體內，相當于該抗原攜帶了若干種抗原決定簇進入機體。一個B淋巴細胞只能接受一種抗原決定簇的刺激，分化為相應的效應B淋巴細胞和記憶B淋巴細胞，并能產生與該抗原決定簇相結合的特異性抗體。即一種抗原決定簇只能引起一種特異性抗體。因而，一種復雜的抗原攜帶若干種抗原決定簇進入機體后，可刺激機體不同的B細胞分化產生多種抗體（圖1）。即一種抗原引起機體產生多種特異性的抗體，這些抗體主要分布于血清。因此，從血清中分離的抗體純度低、靈敏度低、特異性差。

2 單克隆抗體的制備過程中的相關疑點

問題一：如何用選擇培養基篩選雜交瘤細胞？

在小鼠B淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合懸浮液中，放置了多個骨髓瘤細胞與多個多種B淋巴細胞，由于動物細胞融合是一個隨機的過程，所以經融合后細胞將以多種形式出現。如果只考慮兩兩融合的情況，會有融合的骨髓瘤細胞—骨髓瘤細胞、B淋巴細胞—B淋巴細胞、B淋巴細胞—骨髓瘤細胞以及未融合成功的單個骨髓瘤細胞、單個的B淋巴細胞。那么如何從眾多的細胞中篩選出雜交瘤細胞呢？

從眾多類型的細胞中篩選出雜交瘤細胞，普遍采用的HAT選擇性培養基，也就是在普通的動物細胞培養液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。已知細胞中的DNA合成有兩條途徑。① 生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。② 應急途徑或補救途徑（“S途徑”），是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸，然后再合成DNA，兩種酶缺一不可。

在D途徑合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT培養液中氨基喋呤是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。另一事實是人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。而鼠骨髓瘤細胞中雖然沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。

因此，在HAT培養液中，未融合的效應B細胞和B淋巴細胞—B淋巴細胞融合細胞的“D途徑”被氨基喋呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養液中增殖的能力，一般10 d左右會死亡。而骨髓瘤細胞自身沒有“S途徑”，且“D途徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在HAT培養液中也不能增殖而很快死亡。唯有骨髓瘤細胞與效應B細胞相互融合形成的雜交瘤細胞，在HAT選擇性培養基上，既具有效應B細胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細胞在體外培養液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養液中選擇性存活下來，并不斷增殖，這就是所需的雜交瘤細胞。

問題二：在得到雜交瘤細胞后，為什么還要進行再次篩選以及如何進行？

經過選擇培養基篩選，得到的雜交瘤細胞不一定能產生所需的特異抗體。原因包括以下兩個方面：① 經抗原處理過的機體脾臟中提取的細胞不一定都是效應B細胞，因而雜交瘤細胞不一定都能產生抗體；② 由于一種抗原刺激機體可使機體中存在多種漿細胞，所以雜交瘤細胞中有多種類型：AB1、AB2、AB3……它們產生的抗體不一定是所需的抗體，也不是單一的抗體。因此必須從多種雜交瘤細胞中篩選出能產生針對某一特定抗原決定簇的雜交瘤細胞?？贵w的獲得過程見圖2。

通常采用專一抗體檢驗陽性的方法篩選出能產生針對某一特定抗原決定簇的雜交瘤細胞。首先將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔細胞培養板上，使每一孔含一個或幾個雜交瘤細胞，根據抗體和抗原能發生特異性結合的特性去檢測各孔的上清液中細胞分泌的抗體是不是所需要的，再保留或者舍去此孔雜交瘤細胞。通過這樣的篩選，保留能與相應抗原發生特異性結合的雜交瘤細胞。然后，將這樣的細胞進行大量的體內或體外培養，就可得到特異強性靈敏度高的單克隆抗體。

問題三：單克隆抗體為什么純度高，特異性強，靈敏度高？

抗原注射到人和哺乳動物體內，相當于該抗原攜帶了若干個抗原決定簇進入機體。值得說明一下的是，在特異性體液免疫過程中，應該是一種抗原決定簇刺激一種B細胞，一種B細胞增殖分化成一種效應B細胞，一種效應B細胞產生一種具有特定抗原結合部位的抗體，此抗體可以與之相匹配的該抗原決定簇發生特異性結合?？梢?，在選擇培養基上篩選出來的雜交瘤細胞實際上是多種B淋巴細胞和骨髓瘤細胞形成的多種雜交瘤細胞，每種雜交瘤細胞都分泌不同的抗體。再經過專一抗體檢驗陽性后，就篩選出能分泌和該抗原的某一特定抗原決定簇特異性結合的雜交瘤細胞，此時的雜交瘤細胞只有一種，即能無限增殖又能分泌一種抗體。這些抗體均只識別同一種抗原決定簇，因而特異性強、靈敏度高。又由于這種雜交瘤細胞能無限增殖，后代細胞數量多，所以分泌的抗體量多，可大量制備。

參考文獻：

陳閱增.普通生物學[M].北京：高等教育出版社，1997：180.