關(guān)于“單克隆抗體”中相關(guān)問(wèn)題的探討

陳顏

“單克隆抗體”是高中生物選修教材中“動(dòng)物細(xì)胞工程”中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，同時(shí)又是高考的必考內(nèi)容。由于學(xué)生對(duì)免疫的相關(guān)知識(shí)欠缺，造成學(xué)生對(duì)這項(xiàng)現(xiàn)代生物技術(shù)即充滿好奇又難以理解，做題時(shí)無(wú)從下手，錯(cuò)誤百出。因而學(xué)生要達(dá)到課標(biāo)要求的理解、綜合應(yīng)用水平，還需要教師對(duì)教材的內(nèi)容加以拓展和加深，以幫助學(xué)生正確理解單克隆抗體的內(nèi)涵，從而應(yīng)對(duì)各類復(fù)雜的問(wèn)題。

現(xiàn)就學(xué)習(xí)過(guò)程中，學(xué)生難以理解的知識(shí)點(diǎn)加以分析總結(jié)，以幫助學(xué)生正確理解相關(guān)知識(shí)。

1 傳統(tǒng)制備抗體的缺點(diǎn)及理解

長(zhǎng)期以來(lái)，人們?yōu)榱双@得抗體，傳統(tǒng)的方法是向動(dòng)物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動(dòng)物產(chǎn)生抗體，然后從動(dòng)物的血清中分離所需的抗體。這種方法不僅產(chǎn)量低，純度低，而且制備的抗體特異性差。采用傳統(tǒng)方法制備的抗體為什么產(chǎn)量低，純度低，而且特異性差？

由于一種抗原可含有多個(gè)抗原決定簇，這種抗原決定簇可以隱藏在抗原內(nèi)部，也可以暴露在抗原表面。因此當(dāng)一種抗原注射到人或哺乳動(dòng)物體內(nèi)，相當(dāng)于該抗原攜帶了若干種抗原決定簇進(jìn)入機(jī)體。一個(gè)B淋巴細(xì)胞只能接受一種抗原決定簇的刺激，分化為相應(yīng)的效應(yīng)B淋巴細(xì)胞和記憶B淋巴細(xì)胞，并能產(chǎn)生與該抗原決定簇相結(jié)合的特異性抗體。即一種抗原決定簇只能引起一種特異性抗體。因而，一種復(fù)雜的抗原攜帶若干種抗原決定簇進(jìn)入機(jī)體后，可刺激機(jī)體不同的B細(xì)胞分化產(chǎn)生多種抗體（圖1）。即一種抗原引起機(jī)體產(chǎn)生多種特異性的抗體，這些抗體主要分布于血清。因此，從血清中分離的抗體純度低、靈敏度低、特異性差。

2 單克隆抗體的制備過(guò)程中的相關(guān)疑點(diǎn)

問(wèn)題一：如何用選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞？

在小鼠B淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合懸浮液中，放置了多個(gè)骨髓瘤細(xì)胞與多個(gè)多種B淋巴細(xì)胞，由于動(dòng)物細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過(guò)程，所以經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)。如果只考慮兩兩融合的情況，會(huì)有融合的骨髓瘤細(xì)胞—骨髓瘤細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞—B淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞—骨髓瘤細(xì)胞以及未融合成功的單個(gè)骨髓瘤細(xì)胞、單個(gè)的B淋巴細(xì)胞。那么如何從眾多的細(xì)胞中篩選出雜交瘤細(xì)胞呢？

從眾多類型的細(xì)胞中篩選出雜交瘤細(xì)胞，普遍采用的HAT選擇性培養(yǎng)基，也就是在普通的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。已知細(xì)胞中的DNA合成有兩條途徑。① 生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。② 應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑（“S途徑”），是利用次黃嘌呤—鳥(niǎo)嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸，然后再合成DNA，兩種酶缺一不可。

在D途徑合成過(guò)程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過(guò)程，而HAT培養(yǎng)液中氨基喋呤是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。另一事實(shí)是人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。而鼠骨髓瘤細(xì)胞中雖然沒(méi)有S途徑，但能不斷分裂增殖。

因此，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng)B細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞—B淋巴細(xì)胞融合細(xì)胞的“D途徑”被氨基喋呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能力，一般10 d左右會(huì)死亡。而骨髓瘤細(xì)胞自身沒(méi)有“S途徑”，且“D途徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。唯有骨髓瘤細(xì)胞與效應(yīng)B細(xì)胞相互融合形成的雜交瘤細(xì)胞，在HAT選擇性培養(yǎng)基上，既具有效應(yīng)B細(xì)胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長(zhǎng)期增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來(lái)，并不斷增殖，這就是所需的雜交瘤細(xì)胞。

問(wèn)題二：在得到雜交瘤細(xì)胞后，為什么還要進(jìn)行再次篩選以及如何進(jìn)行？

經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)基篩選，得到的雜交瘤細(xì)胞不一定能產(chǎn)生所需的特異抗體。原因包括以下兩個(gè)方面：① 經(jīng)抗原處理過(guò)的機(jī)體脾臟中提取的細(xì)胞不一定都是效應(yīng)B細(xì)胞，因而雜交瘤細(xì)胞不一定都能產(chǎn)生抗體；② 由于一種抗原刺激機(jī)體可使機(jī)體中存在多種漿細(xì)胞，所以雜交瘤細(xì)胞中有多種類型：AB1、AB2、AB3……它們產(chǎn)生的抗體不一定是所需的抗體，也不是單一的抗體。因此必須從多種雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生針對(duì)某一特定抗原決定簇的雜交瘤細(xì)胞。抗體的獲得過(guò)程見(jiàn)圖2。

通常采用專一抗體檢驗(yàn)陽(yáng)性的方法篩選出能產(chǎn)生針對(duì)某一特定抗原決定簇的雜交瘤細(xì)胞。首先將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每一孔含一個(gè)或幾個(gè)雜交瘤細(xì)胞，根據(jù)抗體和抗原能發(fā)生特異性結(jié)合的特性去檢測(cè)各孔的上清液中細(xì)胞分泌的抗體是不是所需要的，再保留或者舍去此孔雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)這樣的篩選，保留能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的雜交瘤細(xì)胞。然后，將這樣的細(xì)胞進(jìn)行大量的體內(nèi)或體外培養(yǎng)，就可得到特異強(qiáng)性靈敏度高的單克隆抗體。

問(wèn)題三：?jiǎn)慰寺】贵w為什么純度高，特異性強(qiáng)，靈敏度高？

抗原注射到人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，相當(dāng)于該抗原攜帶了若干個(gè)抗原決定簇進(jìn)入機(jī)體。值得說(shuō)明一下的是，在特異性體液免疫過(guò)程中，應(yīng)該是一種抗原決定簇刺激一種B細(xì)胞，一種B細(xì)胞增殖分化成一種效應(yīng)B細(xì)胞，一種效應(yīng)B細(xì)胞產(chǎn)生一種具有特定抗原結(jié)合部位的抗體，此抗體可以與之相匹配的該抗原決定簇發(fā)生特異性結(jié)合。可見(jiàn)，在選擇培養(yǎng)基上篩選出來(lái)的雜交瘤細(xì)胞實(shí)際上是多種B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞形成的多種雜交瘤細(xì)胞，每種雜交瘤細(xì)胞都分泌不同的抗體。再經(jīng)過(guò)專一抗體檢驗(yàn)陽(yáng)性后，就篩選出能分泌和該抗原的某一特定抗原決定簇特異性結(jié)合的雜交瘤細(xì)胞，此時(shí)的雜交瘤細(xì)胞只有一種，即能無(wú)限增殖又能分泌一種抗體。這些抗體均只識(shí)別同一種抗原決定簇，因而特異性強(qiáng)、靈敏度高。又由于這種雜交瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖，后代細(xì)胞數(shù)量多，所以分泌的抗體量多，可大量制備。

參考文獻(xiàn)：

陳閱增.普通生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，1997：180.