渦旋輔助—液液萃取—氣相色譜法測定土壤中水和甲醇可提態五氯酚

于雄勝　柳勇　樓駿 　馮小莉　汪海珍　徐建明

摘 要 建立了渦旋輔助-液液萃取-氣相色譜測定土壤中水和甲醇可提態五氯酚（Pentachlorophenol，PCP）的方法。對渦旋轉速、液液體積比等參數進行了優化，即渦旋轉速為2000 r/min時PCP回收率最高，可達97.4%，重復性較好，相對標準偏差（RSD）為0.5%；衍生化溶液與正己烷的體積比為10∶4時PCP回收率為103%，RSD為0.7%。PCP提取測定的標準曲線線性范圍為1.25～4000 μg/L（R2=0.9999），方法檢出限在0.02 μg/L以下，測量范圍較寬，適合于痕量及微量PCP的分析。與傳統液液萃取和固相萃取相比，本方法采用渦旋輔助萃取后有機溶劑消耗量最低、操作步驟最少，且測定的PCP回收率最高，可達96.8%。4種不同類型土壤經水提取一次和甲醇提取3次，在1和10 mg/kg PCP污染條件下，總回收率分別為89.5%～98.9%和88.7%～98.4%，說明本方法滿足了不同類型土壤中水和甲醇可提態PCP在不同濃度范圍內的提取測定要求。

關鍵詞 五氯酚； 渦旋輔助； 液液萃取； 水提態； 甲醇可提態； 土壤

1 引 言

五氯酚（Pentachlorophenol，PCP）及其鈉鹽最初被用作殺菌劑、除草劑、除蟲劑以及木材防腐劑，在世界范圍內廣泛使用。在我國，PCP還被長期用于消滅稻田內寄生血吸蟲的宿主釘螺[1]。PCP化學性質相對穩定，且對生物體具有廣譜毒性和致突變性，被列為環境優先監測的持久性有機污染物之一[2]。雖然包括我國在內的多個國家已禁止或限制使用PCP，但在某些血吸蟲回升地區繼續采用PCP除殺釘螺的現象仍然存在。如今，在水體以及土壤環境中還能檢測出微量或痕量PCP，對農業和自然生態系統以及人類健康構成威脅[3]。

在對PCP分析檢測時，樣品的前期準備（包括凈化和濃縮）至關重要[4]。溶液中PCP的傳統提取方法包括液液萃取（LLE）[5]、固相萃取（SPE）[6，7]等。然而，LLE、SPE等方法需要耗費大量有機溶劑和樣品，需經過濃縮后測定，整個操作程序復雜繁瑣；尤其是SPE方法在分析費用上昂貴，目標物也可能被吸附到柱子上，體系復雜時還容易堵塞柱子。近年，提取凈化方法趨向于向節省樣本、減少試劑消耗、降低環境污染、提高靈敏度、減少人工量的方向發展，由此建立了固相微萃取[8]、液相微萃取[9]以及由此衍生出的各種方法等。然而，微萃取也有一定弊端，如需使用一些特殊的裝置、試劑量太少，導致水分難以去除而對儀器有損害等。本研究借用微萃取思路對LLE方法進行優化，減少有機溶劑用量、保證脫水所需樣品用量，使之具有更廣譜的適用性。對于PCP的測定，常用的方法有氣相色譜-電子捕獲檢測器法 [10，11]、高效液相色譜-紫外檢測法[12]、氣相色譜-串聯質譜法[8]、高效液相色譜-串聯質譜法[6]等。PCP經衍生化后在氣相色譜的電子捕獲檢測器（ECD）上的靈敏度要高于液相色譜的紫外檢測器，又具有普遍性，常用于痕量PCP的分析。

本研究對溶液中PCP的萃取條件進行了優化，基于渦旋輔助-液液萃取-氣相色譜法測定了土壤中水和甲醇可提態PCP，其中水提態PCP是污染土壤中生物有效性和毒性最高的部分，易隨淋溶作用進入地下水、河流等，造成水體污染[13，14]；甲醇可提取態代表易被有機質等土壤組分吸附并固定的PCP[15]，二者同時測定更能全面反映其環境學意義。本方法減少了有機溶劑的用量，且有低的檢出限（LOD），為不同類型土壤中水和甲醇可提態PCP的準確測定提供了方法選擇的依據。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

GC6890N氣相色譜儀（美國Agilent Technologies公司），配有ECD檢測器、7683B series自動進樣器、HP-5（30.0 m×320 μm， 0.25 μm）色譜柱等；MixMate渦旋儀（美國Eppendorf公司）；SK8210HP超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）；Mill-Q超純水儀（法國Millipore公司）；-9210K旋轉搖床（太倉市華利達實驗設備有限公司）；Multifuge 3S離心機（德國Heraeus公司）。

五氯酚（98%，美國Sigma公司）；正己烷和甲醇（色譜純，西班牙Scharlab公司）；丙酮（色譜純，Tida公司）；乙酸酐、K2CO3、H2SO4和無水Na2SO4（分析純，國藥集團）。

2.2 供試土壤

選取4種性質差異較大的土壤為研究對象，分別為浙江水稻土、江西紅壤、黑龍江黑土以及河南潮土。土壤均采自0～20 cm表土層，風干，過2 mm篩，基本理化性質見表1。將以上4種土壤分別制備成1和10 mg/kg PCP污染土壤，即稱取4種土壤每種20 g各兩份于60 mL玻璃離心管中；吸取20和200 mg/L PCP的丙酮溶液各1 mL，分5次小心加入到裝有同種土壤的上述兩份離心管中，分別混合均勻，將離心管置于通風櫥中將丙酮揮發完全，即成為PCP濃度為1和10 mg/kg 的污染土壤；不同土壤的制備過程相同。

2.3 實驗方法

2.3.1 標準曲線 配制100和2000 μg/L的PCP-K2CO3標準溶液，分別吸取100 μg/L的標準溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mL，2000 μg/L的標準溶液1.0、2.0、4.0和8.0 mL， 于10.0 mL介質中，用0.5 mL乙酸酐衍生化后，加入4 mL正己烷萃取衍生化產物乙酸五氯苯酯，吸取部分有機相后，用無水Na2SO4干燥脫水并通過0.22 μm有機相濾膜，得濃度為1.25， 2.5， 5.0， 12.5， 25， 50， 100， 200， 500， 1000， 2000和4000 μg/L的系列標準溶液。endprint

2.3.2 土壤中水提態PCP的萃取測定 取PCP污染土壤2 g于 50 mL離心管中，加入超純水10 mL，于25℃下250 r/min振蕩60 min后，4000 r/min離心20 min，取上清液過0.45 μm有機相濾膜，按以下步驟測定水提態PCP：（1）純化 準確吸取6 mL待測液于30 mL玻璃離心管中，加入0.5 mL 9 mol/L H2SO4充分酸化，使PCP全部以分子態存在（pH<4），再用6 mL正己烷渦旋振蕩2 min，使PCP進入有機相，2500 r/min離心3 min后，吸除下層水相，上層正己烷相分別用0.2 mol/L K2CO3分兩次反萃，使PCP進入K2CO3溶液中，合并兩次反萃溶液。（2）衍生化 在收集反萃液中，加入0.5 mL乙酸酐，搖動玻璃離心管，釋放氣泡，25℃下200 r/min振蕩20 min，使PCP衍化生成乙酸五氯苯酯。（3）渦旋輔助萃取 衍生化后的溶液按優化后的萃取條件加入適量正己烷進行渦旋輔助萃取，以一定渦旋轉速萃取2 min。（4）脫水測定 2500 r/min離心3 min后，吸取上層有機相，用1 g無水Na2SO4干燥脫水，并過0.22 μm有機相濾膜后進行測定。

2.3.3 土壤中甲醇可提態PCP的萃取測定 取2.3.2節中水提取后的土壤，倒盡上清液后，用9 mol/L H2SO4調至pH<4，加入10 mL甲醇進行超聲提取（25℃，54 kHz，30 min），然后3000 r/min離心10 min，收集上清液。用相同的方法繼續提取兩次，收集各自提取液于30 mL離心管中，用氮氣吹干至約0.5 mL，再加入0.2 mol/L K2CO3溶液10 mL， 乙酸酐0.5 mL振蕩發生衍生化反應，最后按2.3.2節步驟（3）、（4）操作。

2.4 色譜條件

載氣為氮氣，流速2.0 mL/min。升溫程序：柱初始溫度80℃，保持1 min，以30℃/min升溫到220℃，繼續以5℃/min升溫到230℃，保持3 min，最后以30℃/min升溫到250℃，保持1 min； 進樣口溫度為250℃，ECD溫度為300℃。不分流進樣，進樣量1 μL，外標法定量[11]。每個樣品分析時間為11.8 min。

2.5 實驗數據分析

采用Origin 8.0和Microsoft Office Excel 2013軟件進行圖表編輯。圖表中，PCP回收率數據表示為算數平均值±標準差。采用IBM SPSS Statistics 20軟件進行數理統計分析。單因素方差分析采用LSD法；所有統計檢驗均以α=0.05為顯著水準，采用小寫字母標注顯著性。

3 結果與討論

3.1 溶液中PCP的萃取條件優化

3.1.1 渦旋時間和轉速的影響

先比較了渦旋時間對回收率的影響，發現在1～5 min范圍內回收率沒有顯著差異，與文獻[4]的研究結果一致。為便于操作，所有渦旋時間都設定為2 min。之后考察了渦旋轉速（500、1000、1500、2000、2500和3000 r/min）對萃取率的影響。實驗表明，隨著渦旋轉速的增大，回收率升高，重復性變好，500和2000 r/min時回收率分別為70.5%和97.4%，相對標準偏差（RSD）分別為3.1%和0.5%；渦旋轉速大于2500 r/min后，回收率降低，重復性也變差，3000 r/min時回收率為79.2%，RSD為5.6%（圖1）。

究其原因，渦旋轉速達到3000 r/min時，溶液急劇旋轉，大量溶液濺到離心管蓋上，引起回收率降低；而轉速太低時，兩種液相不能充分混合，也導致回收率偏低。本研究選擇2000 r/min。

3.1.2 液液體積比的影響 研究了衍生化溶液與正己烷體積比（10∶6、10∶4、10∶3、10∶2、10∶1），對衍生化溶液萃取效率及穩定性的影響。由表2可知，各萃取比下回收率在99.3%～111%之間，RSD在0.1%～2.2%之間，萃取的穩定性隨著體積比的增大呈現出變差的趨勢。綜合而言，衍生化溶液-正己烷=10∶4（V∶V）時萃取測定的PCP回收率較高（103%），重復性較好（RSD為0.7%），且便于操作。

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3.2 標準曲線

在1.25～200 μg/L、200～4000 μg/L以及1.25～4000 μg/L范圍內，待測液中PCP濃度（CPCP，μg/L）與色譜峰積分面積（A）有很好的線性關系，具有較寬的線性范圍。其回歸方程分別為： A=9.9665CPCP + 22.879（R2=0.9998）； A=9.9627CPCP-113.92（R2=0.9999）；A=9.5857CPCP-1.7667（R2=0.9999）。方法的LOD以信噪比3倍計為0.02 μg/L。說明方法靈敏度高，適合于痕量及微量PCP的分析。

3.3 土壤中PCP的提取測定

3.3.1 反萃取回收率的驗證

He等[16]研究表明，紅壤有機質含量一般較低，在不同類型土壤中對PCP的吸附容量較小。因此，選取江西紅壤為測試土壤，制備干凈紅壤提取液并加標至100 μg/L，萃取

后的有機相用10和6 mL K2CO3溶液分兩次反萃取，驗證純化步驟中PCP的反萃取回收率。結果表明，第一次回收率為96.9%，RSD為1.2%；第二次回收率為4.4%，RSD為9.4%；兩次總回收率為100.9%，且有好的重復性（RSD為0.9%），可見兩次足以將PCP反萃取完全（表3）。

3.3.2 渦旋輔助萃取回收率的驗證 同3.3.1節制備干凈紅壤提取液并加標到100 μg/L，驗證渦旋輔助萃取（VALLE）步驟中PCP的回收率，并與LLE、SPE方法比較。LLE方法參照環保部591-2010標準[5]，回收率為91.4%，RSD為2.6%；SPE方法參照文獻[6]，回收率為83.3%，RSD為5.2%； VALLE方法回收率達96.8%，RSD為3.8%（圖2）。相比于LLE、SPE方法，endprint

VALLE方法有機溶劑消耗量最低、操作步驟最少，且回收率最高。尤其是，渦旋輔助可以縮短提取時間[17]，并減小處理間人為操作的不穩定性。

3.3.3 水和甲醇可提態PCP的提取測定 采取水和甲醇連續提取的方法，結合之前摸索出的最佳提取條件，在不同類型土壤（水稻土、紅壤、黑土、潮土）以及不同污染條件（1， 10 mg/kg）下驗證渦旋輔助-液液萃取-氣相色譜法在PCP測定中的可靠性。由圖3可見，4種土壤在1 mg/kg PCP污染條件下總回收率為89.5%～98.9%，10 mg/kg PCP污染條件下總回收率為88.7%～98.4%；1 mg/kg PCP污染土壤回收率重復性優于10 mg/kg PCP污染土壤。不同類型土壤總的回收率在1 mg/kg PCP污染條件下有顯著差異（P<0.05），而10 mg/kg PCP污染條件下無顯著差異；不同污染條件下水稻土和黑土的總回收率最高，潮土最低，但總回收率均符合要求，說明用水提取1次以及甲醇提取3次可將PCP提取完全。不同類型土壤中PCP的水提取比例有顯著差異（P<0.05），水提取比例呈現出從水稻土到潮土逐漸升高的趨勢。這主要是因為，PCP在水中的溶解度受pH值影響較大[18]，隨著土壤pH值的升高，水提取比例也逐漸上升；粒徑含量大小也會影響土壤對PCP的吸附，其中較高的粘粒含量下土壤對PCP吸附作用增強[19]，導致水提取態比例呈降低趨勢（潮土除外），這與文獻[10]的研究結果一致。

實驗結果表明，渦旋輔助-液液萃取-氣相色譜法滿足了不同類型土壤中不同形態PCP在不同濃度范圍內的提取測定，為水和甲醇可提態PCP的準確測定提供了方法選擇的依據。

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