四級桿串聯質譜分析芐嘧磺隆污染蟾蜍耳后腺中蟾蜍甾烯水平

周婧　王洪蘭　馬宏躍　閆文麗　龔艷　錢琎　段金廒　吳啟南

摘 要 研究了除草劑芐嘧磺隆皮膚接觸污染對中華大蟾蜍分泌蟾酥化學品質的影響。蟾酥樣品經甲醇提取，以乙腈-1%甲酸水溶液為流動相，液相色譜（反相C18柱）分離＼， 串聯質譜（LC-MS/MS）分析檢測。質譜條件為：MRM模式，脫溶劑溫度500℃，碰撞電壓30 eV，錐孔電壓為30 V。結果表明，建立的LC-MS/MS測定方法對6種蟾蜍甾烯標準物質的檢出限為0.42～4.86 ng/mL，相關系數R2=0.9953～0.9992，日內和日間RSD為3.8%～6.8%和4.0%～8.8%；加樣回收率為96.9%～109.6%，相對標準偏差為2.0%～8.1%。應用此方法檢測了36種蟾蜍甾烯化合物，有20余種化合物自身質譜積分面積在芐嘧磺隆污染前后發生改變，芐嘧磺隆皮膚接觸污染可以改變蟾蜍耳后腺蟾蜍毒素的表達模式。本方法可應用于蟾蜍甾烯類物質檢測。

關鍵詞 中藥資源學； 蟾蜍； 芐嘧磺??； 蟾酥

1 引 言

蟾酥為中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider耳后腺的干燥分泌物。以往研究顯示，蟾酥化學質量差異較大[1，2]，不同產地商品中蟾蜍甾烯類成分含量相差數倍至數十倍。其原因除了遺傳因素外，環境影響尤為重要。據調查，中藥材蟾酥主要來自于野生蟾蜍，蟾蜍皮膚具有通透性，對環境重金屬、農藥、生活（工業）污水敏感[3]，是環境科學研究的前哨物種。污染物能在蟾蜍體內蓄積和放大，但是污染物對蟾蜍耳后腺分泌物形成的影響研究甚少。

蟾酥主要含有強心苷類蟾蜍甾烯化合物，其含量測定方法大體可分為有LC-UV和LC-MS兩類。MS在蟾蜍甾烯定性鑒別和定量靈敏度方面均顯著優于UV方法。已有學者采用Q-TOF和LTQ-Orbitrap對多種蟾蜍甾烯的質譜二級裂解模式進行特征和含量分析[3～10]。在此基礎上，本研究采用四級桿串聯質對蟾酥中36種蟾蜍甾烯進行檢測，以質譜積分面積表示每種蟾蜍甾烯化合物在不同樣本組間的相對含量（化合物自身比較），并結合數學模式識別方法，評估芐嘧磺隆污染前后蟾蜍分泌蟾酥化學性質的變化。2 實驗部分

2.1 儀器與材料

Waters Xevo-TQ 三重四極桿質譜儀， 配備Acquity UPLC 系統（包括四元泵溶劑系統、在線脫氣機和自動進樣器）， 同時配有Waters Masslynx V4.1數據工作站 （美國Waters 公司）； 低溫超高速離心機（美國Thermo公司）；離心濃縮儀、冷凍干燥儀（Labconco公司）；EPED超純水系統（南京易普達易科技發展有限公司）；電子分析天平（上海精密儀器廠）； 蟾蜍甾烯標準品Cinobufotalin，Resibufagenin，Gamabufotalin，Hellebrigenin，Cinobufagin 和Bufotalin按文獻[1]報道方法分離制備，高效液相色譜鑒定純度大于95%；芐嘧磺隆（丁貝生物公司）。中華大蟾蜍（捕于南京周邊）。

2.2 芐嘧磺隆污染蟾蜍的分組與取樣

中華大蟾蜍30只， 產地為江蘇省，均分成3組，組間個體無顯著差異。配制芐嘧磺隆低劑量組（0.15 g/L），高劑量組（0.3 g/L）及正常組（0 g/L）。中華大蟾蜍飼養在含或不含芐嘧磺隆的水溶液中。用分析天平稱取芐嘧磺隆0.15和0.30 g，加到1 L盛有隔夜自來水的燒杯中，攪拌，使之充分溶解。待蟾蜍取食完畢后，將上述配好的藥液倒入蟾蜍培養箱中，培養2天后，倒掉培養箱中原液，把培養箱沖洗干凈，給蟾蜍喂食，待取食完畢后，加入藥液，如此反復，培養半個月。抓取蟾蜍，稱體重。用包裹膠布的鑷子擠壓蟾蜍耳后腺，使蟾酥噴濺到載玻片上，將鮮酥刮至EP管中，冷凍干燥，記錄凍干前后蟾酥的重量。

2.3 供試品溶液的制備

將干燥后的蟾酥樣本于研缽中研磨成粉末（未過篩），每個樣本準確稱取10 mg，置于玻璃試管中，分別準確加入5 mL甲醇，保鮮膜封口，超聲提取30 min，冷卻后經0.22 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4 色譜/質譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）； 柱溫35.0℃；流速0.4 mL/min； 進樣量5 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序： 0～2 min， 20%～30% B； 2～6 min， 30%～35% B； 6～9 min， 35%～60% B； 9～10 min， 60%～95% B； 10～11 min， 95% B； 11～11.20 min： 95%～20% B。

離子源為電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測；質量掃描范圍為 MS1：20～1974 Da，MS2：2～2048 Da；掃描速率為 M1：100～2000 amu/s，M2：100～10000 amu/s；毛細管電壓為3.00 kV；錐孔電壓為30.00 V；離子源溫度為150℃；脫溶劑氣體流速為998 L/h；脫溶劑溫度500℃。參照文獻[8～15]總結蟾蜍甾烯化合物的分子離子和子離子，經UPLC-MS/MS預測，選取36種化合物（表1），其響應較強、干擾較小的兩對子離子可用于定性分析，目標化合物檢測離子對碰撞電壓（CE）統一設置為30 eV，可以滿足蟾酥生藥中蟾蜍甾烯的測定。

2.5 數據處理

采用Waters公司的MarkerLynx XS軟件進行數據的組間比較，用偏最小方差判別分析（PLS-DA）模型對正常對照組和污染組進行模式識別，利用有監督的OPLS-DA模型排除與樣品分類無關的信息，得到變量權重值（Variable important in projection，VIP）。標記的為VIP>1的變量，具有統計學意義，其中p[1]絕對值越大，對組間差異的貢獻度越大；p（corr）絕對值越大，分析結果的置信度越高。同時篩選含量差異為1.5倍以上的甾體物質為組間差異標志物。實驗數據以均數±標準差（±s）表示。3 結果與討論endprint

3.1 蟾蜍甾烯類化合物的質譜檢測

采用多反應檢測模式（MRM）對蟾酥中蟾蜍甾烯水平進行測定。蟾蜍甾烯在陽離子模式下的質譜信號相應優于陰離子模式。基于文獻報道[3～7]和本研究組研究確證，共收集了30余種蟾蜍甾烯類化合物的離子對信息用于MRM模式檢測（表1）。蟾蜍甾烯類化合物具有相同的6-元內酯環甾體母核，母核上有羥基、醛基、環氧基、乙酰基等基團取代，在二級質譜碎裂時產生有規律性的裂解特征。圖1是UPLC-Q-TOF測定蟾酥總離子流圖，圖2為蟾酥中含量較高3種質控成分質譜二級碎裂圖譜。如Resibufogenin，[M+H]+ 385， [M+H-H2O]+ 367， [M+H-2H2O]+ 349，[M+H-2H2O-C5H4O2]+ 253；Cinobufagin，[M+H]+ 443，[M+H-CH2CO]+ 401，[M+H-HOAc]+ 383，[M+H-HOAc-H2O]+ 365，[M+H-HOAc-2H2O]+ 347。3種蟾蜍甾烯MS/MS圖均顯示，母離子脫去H2O （18 Da）和CO （28 Da） 是一種顯著的裂解特征；當蟾蜍甾烯存在乙酰基取代時，母離子可以脫去HOAC （60 Da） 或C5H4O2。使用不同的離子對信息（母離子/子離子）可以區分蟾蜍甾烯化合物；對于具有相同離子對信息的物質，根據其色譜保留時間不同，進一步區分。圖3為蟾酥中代表性化合物的離子流提取色譜圖。

3.2 蟾蜍甾烯類化合物測定方法學考察

配制不同濃度的混標物的甲醇溶液（16， 80， 400， 2000和10000 ng/mL），以峰面積為縱坐標（y），標準品溶液質量濃度（ng/mL）為橫坐標（x），繪制標準曲線。由表2可知，所有測試標準化合物在測試濃度內具有良好的線性關系（R2=0.9953～0.9992）。按信噪比（S/N）為3計算檢出限（LOD）為0.42～4.86 ng/mL，按S/N=10計算定量限（LOQ）為1.41～16.20 ng/mL。對于日內精密度考察，

將混合標準品溶液（2000 ng/mL）連續進樣6次分析，以峰面積計算RSD為3.8%～6.8%；3天連續測定的日間精密度RSD為4.0%～8.8%，表明儀器測定結果穩定。進一步將蟾酥樣品溶液于4℃條件下存放0， 2， 4， 8， 12和24 h，測定蟾酥中6種蟾蜍甾烯的含量標準偏差在2.4%～8.4%，說明待測試的蟾酥樣品溶液在4℃存放條件下質量穩定。對于加樣回收率測試，準確稱取已知含量的蟾酥粉末2 mg，加入1 mL混合標準溶液（濃度2000 ng/mL），1 mL甲醇，按2.3節制備供試品溶液測定，計算得6種標準甾烯化合物的加標回收率在96.9%～109.6%之間，相對標準偏差RSD在2.0%～8.1%之間。

3.3 不同濃度芐嘧磺隆污染對中華大蟾蜍分泌蟾酥的化學質量的影響

在上述色譜-質譜條件下，蟾蜍甾烯通過質譜響應的積分面積進行相對定量（表3）。與正常組相比較，芐嘧磺隆污染組的蟾蜍分泌蟾酥的化學質量明顯不同，芐嘧磺隆低劑量組中，7種游離型蟾蜍甾烯、2種結合型蟾蜍甾烯水平發生1.5倍上調，6種游離型蟾蜍甾烯、3種結合型蟾蜍甾烯的水平發生1.5倍下調。在芐嘧磺隆高劑量組，9種游離型蟾蜍甾烯、2種結合型蟾蜍甾烯水平發生1.5倍上調，3種游離型蟾蜍甾烯、4種結合型蟾蜍甾烯的水平發生1.5倍下調。

將上述不同組別的蟾蜍甾烯的含量數據導入MassLynx V4.1 software （Waters Corp.， Milford， USA）軟件，進行數據的主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。由于蟾蜍耳后腺分泌的蟾酥的化學質量存在較大的組內差別，采用無監督的PCA方式不能對正常組蟾酥和芐嘧磺隆污染組蟾酥進行組間的分離。進一步采用有監督的PLS-DA統計方法進行了組間的區分（圖4）。其中變量權重值（Variable important in projection，VIP）>1的變量，具有統計學意義，其中p[1]絕對值越大，對組間差異的貢獻度越大；p（corr）絕對值越大，分析結果的置信度越高，同時變量指標平均含量差異發生1.5倍以上改變的甾體物質為組間差異標志物，總計16種差異標志物?？梢?，芐嘧磺隆污染會使蟾蜍毒素的表達模式發生改變。

4 結 論

蟾蜍耳后腺的分泌物是蟾蜍受到外界刺激，合成并分泌的具有自我保護作用的毒性物質。作為常用抗腫瘤中藥，其化學質量波動常影響臨床用藥的有效性與安全性。采用建立的蟾蜍甾烯質譜檢測方法對不同劑量除草劑芐嘧磺隆污染蟾蜍的蟾酥質量評價。結果表明，正常組和芐嘧磺隆組中大部分甾烯類物質可以被定性檢測和相對定量分析，芐嘧磺隆污染組中多種蟾蜍甾烯表達模式出現明顯改變，進一步加大了蟾酥的質量不穩定性，增加用藥風險。雖然芐嘧磺隆污染影響蟾蜍甾烯表達的原因尚不清楚，推測芐嘧磺隆可能抑制或刺激了蟾蜍耳后腺中合成蟾蜍甾烯的相關酶系，使得蟾蜍甾烯生物合成受到影響。總之，本文所建立的四級桿串聯質譜測定蟾蜍甾烯類成分的方法具有靈敏、快速、穩定的特點，能有效滿足不同條件下蟾蜍耳后腺分泌物中蟾蜍甾烯成分的質量評價要求。

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