基于超高效液相色譜—質(zhì)譜的藥物性肝損傷患者血清代謝組學(xué)研究

安卓玲　史忱　趙瑞　李鵬飛　劉麗宏

摘 要 利用超高效液相色譜與四級(jí)桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS/MS）結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，開(kāi)展健康者與腫瘤藥物、中藥、他汀類(lèi)降脂藥、抗菌藥引發(fā)肝損傷患者的血清代謝組學(xué)研究。血清樣本采用冰乙腈沉淀蛋白，HSS T3-C18色譜柱，水（含0.01%甲酸）與乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定?；诮】嫡吲c藥物性肝損傷初診病例代謝輪廓的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）以及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），尋找114個(gè)與藥物性肝損傷早期診斷密切相關(guān)的氨基酸類(lèi)生物標(biāo)志物，其中有38個(gè)代謝物在兩組間具有顯著差異（p<0.001）。對(duì)各組分離貢獻(xiàn)大的化合物進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，經(jīng)Human Metabolome Database（HMDB）等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索， 進(jìn)行質(zhì)譜信息匹配， 鑒定出與藥物性肝損傷相關(guān)的可能生物標(biāo)志物苯丙氨酸和二甲基鳥(niǎo)苷。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 藥物性肝損傷； 血清； 代謝組學(xué)； 生物標(biāo)志物

1 引 言

隨著新藥的廣泛應(yīng)用以及聯(lián)合用藥的增多，藥物性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）臨床常見(jiàn)且發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)[1～4]。藥物性肝損傷是指治療過(guò)程中使用治療劑量的藥物，機(jī)體受藥物及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的毒性作用引起受藥機(jī)體肝臟損害，表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死、膽汁瘀積、脂肪肝、慢性肝炎、肝硬化等各種肝病。臨床應(yīng)用中各類(lèi)藥物都有肝損傷的相關(guān)報(bào)道，以抗菌藥物、非甾體類(lèi)抗炎藥、抗結(jié)核藥、抗腫瘤等藥物為主，中草藥與保健品的肝毒性發(fā)生率也有上升趨勢(shì)[5～8]。藥物性肝損傷是藥物本身對(duì)肝臟的損害，也可能是機(jī)體對(duì)藥物的特異質(zhì)反應(yīng)，原來(lái)沒(méi)有肝病的人群或以往就有肝病的患者都可能發(fā)生不同程度的肝臟損害[9，10]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約40%肝炎和25%急性肝衰竭都是由藥物引起的[11]，藥物性肝損傷在住院患者中的發(fā)病率為1%～5%，占急性肝損傷住院病例的10%[12]。因此，藥物性肝損傷指標(biāo)的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)于有效降低治療期間的用藥風(fēng)險(xiǎn)、保障患者的用藥安全至關(guān)重要。

目前，藥物治療過(guò)程中發(fā)生的肝損傷具有一定的隱匿性，易與基礎(chǔ)疾病癥狀混淆，臨床上缺乏用于藥物性肝損傷早期發(fā)現(xiàn)的敏感性和特異性小分子標(biāo)志物，僅根據(jù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）等傳統(tǒng)指標(biāo)， 聯(lián)合病理組織學(xué)檢查， 很難在肝損傷發(fā)生之前進(jìn)行準(zhǔn)確而及時(shí)的預(yù)警[13，14]。另外，現(xiàn)階段藥物性肝損傷的研究往往針對(duì)單一藥物的機(jī)制探討或回顧性分析，缺乏臨床常用藥物引發(fā)肝損傷的共性研究及共性判定指標(biāo)，很難在相對(duì)獨(dú)立的研究結(jié)果中真正建立各類(lèi)藥物肝損傷之間的聯(lián)系，嚴(yán)重阻礙了藥物性肝損傷的早期預(yù)警及防治[15，16]。代謝組學(xué)（Metabonomics）比單一靶標(biāo)具有更好的預(yù)見(jiàn)性和可靠性，更有利于準(zhǔn)確、有效地判定毒副作用程度，能夠?qū)ふ矣糜谠缙诎l(fā)現(xiàn)藥物性肝損傷的相關(guān)生物標(biāo)志物，在疾病的早期發(fā)現(xiàn)、機(jī)制研究及藥物安全性評(píng)價(jià)等方面發(fā)揮重要作用[17～19]?；谒幬镄愿螕p傷研究中的難點(diǎn)問(wèn)題，本研究率先采用LC-MS/MS技術(shù)開(kāi)展健康者及臨床藥物肝損傷初診病例血清的代謝組學(xué)研究，探索內(nèi)源性代謝物濃度變化與藥物性肝損傷之間的相關(guān)性，以臨床數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)探索藥物性肝損傷相關(guān)的可能生物標(biāo)志物。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UltiMate 3000 UPLC 系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Scientific公司），配有雙三元液相色譜梯度泵系統(tǒng)（包含在線(xiàn)脫氣單元）、柱溫箱、DAD紫外檢測(cè)器及Chromeleon色譜系統(tǒng)控制軟件；Q EXACTIVE 四級(jí)桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Scientific公司），配有ESI源及Xcalibur數(shù)據(jù)系統(tǒng)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3-C18色譜柱 （10 cm × 2.1 mm， 1.8 μm）。SAVANT SPD121 P SpeedVac離心濃縮儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；Captiva 96 孔過(guò)濾板-0.2 μm（Agilent Technologies公司）。乙腈、甲醇和甲酸（色譜純，德國(guó)Merck公司），實(shí)驗(yàn)用純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2.2 樣品收集和制備

以臨床病歷診斷及肝臟狀態(tài)相關(guān)的酶學(xué)指標(biāo)為依據(jù)，嚴(yán)格執(zhí)行入組標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)，收集了21例健康者與24例藥物性肝損傷（6例抗腫瘤藥物、4例中藥、13例降脂藥及1例抗菌藥物）初診患者的血清樣本（見(jiàn)表1），具體信息詳見(jiàn)附錄1。取100 μL血清，加入300 μL冰乙腈沉淀蛋白，渦旋4 min，于4℃下10000 r/min離心10 min ，取上清液200 μL，置于離心濃縮儀，在36℃條件下，干燥60～90 min。以200 μL 2%乙腈復(fù)溶，經(jīng)0.2 μm Captiva 96 孔過(guò)濾板過(guò)濾，待UPLC-MS分析。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件及樣品分析

色譜條件：A超純水（含0.01%甲酸），B乙腈；梯度洗脫：0～9 min，2%～60% B； 9～18 min，60% B；18～20 min，60%～100% B。柱溫：50℃；流速：0.25 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件： 全掃描； 離子化方式： 加熱ESI源HESI； 噴霧電壓： 3500V（+）/3300（-）； 鞘氣： 4.46 MPa（+）/0.68 MPa（-）； 輔助氣： 1.02 MPa（+）/無(wú)（-）； 離子傳輸管溫度： 320℃。

質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1000，分辨率70000 FWHM，使用氣體均為氮?dú)?，?shù)據(jù)采集軟件使用Xcalibur數(shù)據(jù)系統(tǒng)。被測(cè)樣品通過(guò)正、負(fù)離子模式的UPLC-MS譜分析后，利用信息依賴(lài)的數(shù)據(jù)采集（Information dependent acquisition， IDA）功能，獲得相關(guān)代謝物的MS/MS譜。碰撞能量（CE）設(shè)定為30 eV或 10 eV。正離子模式選用背景離子鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)的相關(guān)離子（m/z 149.0233， 279.1591， 391.2843）進(jìn)行自動(dòng)校正。endprint

本研究將健康者血清樣本進(jìn)行混合制得質(zhì)控樣本（Quality control，QC），通過(guò)連續(xù)6針進(jìn)樣平衡系統(tǒng)，保證系統(tǒng)的適應(yīng)性。另外，QC作為實(shí)際樣本插入檢測(cè)序列中，以QC數(shù)據(jù)的PCA得分圖監(jiān)測(cè)方法的穩(wěn)定性。

2.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)上述健康者與藥物性肝損傷血清樣本進(jìn)行UPLC-（±）ESIMS分析，通過(guò)R命令的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方法，刪除若干同位素離子與加合離子，完成峰識(shí)別、峰對(duì)齊、峰匹配和峰強(qiáng)度校正，最終獲得包括保留時(shí)間、質(zhì)荷比與峰面積的二維數(shù)據(jù)陣。再將轉(zhuǎn)化獲得數(shù)據(jù)陣導(dǎo)入SIMCA-P軟件 （version 13.0， Umetrics AB， Ume， Sweden）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立模式識(shí)別模型并提取差異變量，獲得對(duì)分組有貢獻(xiàn)的變量。通過(guò)高分辨MS譜、MS/MS譜、網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以及代謝物的質(zhì)譜裂解規(guī)律對(duì)差異代謝物即可能生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。數(shù)據(jù)庫(kù)主要包括：human metabolite database （http：//hmdb.ca/）；PubChem compound database （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）；METLIN （http：//metlin.scripps.edu/）；KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/ligand.html）。

3 結(jié)果與討論

3.1 健康者與藥物性肝損傷臨床患者的病例信息與酶學(xué)指標(biāo)

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析方法對(duì)組間生化結(jié)果進(jìn)行比較。藥物性肝損傷患者血清的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）均有異常升高，其中中藥、他汀類(lèi)降脂藥相關(guān)肝損傷的血清ALT與AST顯著增加（p<0.01），抗腫瘤藥的血清ALT有明顯增加（p<0.05）， 一例抗菌藥相關(guān)肝損傷AST與ALT顯著增加，超過(guò)3倍正常值上限。

3.2 藥物性肝損傷的血清代謝組學(xué)研究

3.2.1 血清代謝輪廓分析 采用UPLC-MS/MS方法對(duì)24例藥物性肝損傷（6例抗腫瘤藥物、4例中藥、13例降脂藥及1例抗菌藥物）血清樣本進(jìn)行樣本的分離與數(shù)據(jù)采集。在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下，健康者與藥物性肝損傷患者的總離子流色譜圖（TIC，total ion chromatography）見(jiàn)圖1，兩組具有明顯差異，并且從正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的同一樣本TIC圖可以初步看出兩種離子檢測(cè)模式的互補(bǔ)性，生物樣本中眾多代謝物得到了很好的分離，保留時(shí)間在27 min以?xún)?nèi)。本方法適合于代謝組學(xué)對(duì)于代謝物全面性、完整性的要求，滿(mǎn)足大樣本檢測(cè)分析的要求。

3.2.2 潛在生物標(biāo)志物的鑒定 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis， OPLS-DA）分析，并使用偏最小二乘法判別分析（Partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA）模型進(jìn)行置換驗(yàn)證（Permutation test），從而避免相應(yīng)模式的過(guò)度擬合，確保數(shù)據(jù)模型模型的可靠性。正離子檢測(cè)模式下血清樣本的OPLS-DA結(jié)果見(jiàn)圖2A，交叉驗(yàn)證顯示預(yù)測(cè)能力Q2Y=0.706，46%的變量 [R2（X）] 可用于解釋79.5%的組間差異[R2（Y）]。負(fù)離子檢測(cè)模式下血清樣本的OPLS-DA結(jié)果見(jiàn)圖2B，Q2Y=0.83，45.8%的變量 [R2（X）] 可用于解釋88%的組間差異[R2（Y）]。置換驗(yàn)證結(jié)果中R2Y（綠色三角）與真實(shí)模型的R2Y值共同構(gòu)成的回歸線(xiàn)截距分別為0.186，經(jīng)100次建模獲得的Q2Y（藍(lán)色方塊）與真實(shí)模型的Q2Y值共同構(gòu)成的回歸線(xiàn)截距≤ 0.05，如圖3所示。以上結(jié)果表明， 在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下，血清樣本的多變量數(shù)據(jù)模型符合參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，可有效、可靠地應(yīng)用于可能生物標(biāo)志物的篩選。

結(jié)合OPLS-DA模型中變量的VIP值，S-plot 載荷圖，帶Jack-knifed 置信區(qū)間的載荷圖和原始變量輪廓圖，對(duì)差異變量進(jìn)行篩選和可靠性驗(yàn)證，并通過(guò)均值t-檢驗(yàn)刪除兩組間沒(méi)有顯著性差異（p>0.05）的變量。本研究共尋找114個(gè)與藥物性肝損傷早期診斷密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，其中有38種代謝物在兩組間具有顯著差異（p<0.001）。通過(guò)高分辨MS、MS/MS譜分析、網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)合代謝物結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜裂解特征，推斷可能生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)，詳見(jiàn)附錄2，已鑒定出兩個(gè)可能生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)，包括苯丙氨酸和二甲基鳥(niǎo)苷，如表2所示。

3.3 可能生物標(biāo)志物的生物學(xué)意義

二甲基鳥(niǎo)苷是RNA的降解產(chǎn)物，有研究發(fā)現(xiàn)， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物猴的肝癌模型尿液中二甲基鳥(niǎo)苷濃度增加是tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性與能力高度表達(dá)的結(jié)果[20]，但尚未有研究發(fā)現(xiàn)二甲基鳥(niǎo)苷與藥物性肝損傷之間的關(guān)聯(lián)。另外，肝臟是芳香族氨基酸的主要代謝場(chǎng)所，肝臟的氨基酸代謝減弱、肝細(xì)胞壞死及蛋白質(zhì)分解加強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致氨基酸在肝細(xì)胞中的濃度增高[21～24]。本研究中二甲基鳥(niǎo)苷與苯丙氨酸在藥物性肝損傷患者血清中的濃度異常增高，提示其可能為藥物性肝損傷相關(guān)的可能生物標(biāo)志物，并且氨基酸與核苷代謝通路可能是藥物性肝損傷的重要代謝途徑。

4 結(jié) 論

本研究運(yùn)用正、負(fù)離子檢測(cè)模式的UPLC-MS/MS 技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行了臨床藥物性肝損傷患者血清的代謝組學(xué)研究，已鑒定出兩個(gè)在肝損傷初診患者與健康人血清中存在顯著性差異的可能生物標(biāo)志物結(jié)構(gòu)，分別為苯丙氨酸和二甲基鳥(niǎo)苷。今后的研究將繼續(xù)對(duì)可能生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并深入闡述其生物學(xué)意義，為藥物性肝損傷的早期發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

References

1 Rangnekar A S， Fontana R J. Minerva Gastroenterol. Dietol.， 2011， 57（2）： 213-229endprint

2 Matsumoto K. Rinsho Byori.， 2011， 59（12）： 1117-1122

3 Suk K T， Kim D J. Clin. Mol. Hepatol.， 2012， 18（3）： 249-257

4 Corsini A， Ganey P， Ju C， Kaplowitz N， Pessayre D， Roth R， Watkins P B， Albassam M， Liu B， Stancic S， Suter L， Bortolini M. Drug Saf.， 2012， 35（12）： 1099-1117

5 Robles M， Toscano E， Cotta J， Lucena M I， Andrade R J. Curr. Drug. Saf.， 2010， 5（3）： 212-222

6 Senousy B E， Belal S I， Draganov P V. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol.， 2010， 7（10）： 543-556

7 Agúndez J A， Lucena M I， Martínez C， Andrade R J， Blanca M， Ayuso P， García-Martín E. Expert. Opin. Drug. Metab. Toxicol.， 2011， 7（7）： 817-828

8 GAO Xu-Dong， FAN Yan-Hua. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi.， 2009， 17（6）： 478-480

高旭東， 樊艷華. 中華肝臟病雜志， 2009， 17（6）： 478-480

9 XU Xin， QU Cai-Qin. Medical Recapitulate. 2008， 14（5）： 747-749

徐 鑫， 屈彩芹. 醫(yī)學(xué)綜述， 2008， 14（5）： 747-749

10 SUO Qi-Rong. China clinical practical medicine， 2010， 4（5）： 171-172

所齊嶸. 中國(guó)臨床實(shí)用醫(yī)學(xué)， 2010， 4（5）： 171-172

11 Denk H. Verb. Diseh. Ges. Pathol.， 2002， 86： 120-125

12 Meier Y， Cavallaro M， Roos M， Pauli-Magnus C， Folkers G， Meier P J， Fattinger K. Eur J Clin Pharmacol.， 2005， 61： 135-143

13 GAO Xu-Cong， CHAI Zhen-Hai， ZHANG Zong-Peng. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology， 2012， 26 （5）： 692-696

高緒聰， 柴振海， 張宗鵬. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志， 2012， 26 （5）： 692-696

14 YANG Jiao， L Wen-Liang. Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， 2012， 21（12）： 1359-1363

楊 佼， 呂文良. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2012， 21（12）： 1359-1363

15 Woodhead J L， Howell B A， Yang Y， Harrill A H， Clewell H J 3rd， Andersen M E， Siler S Q， Watkins P B. J. Pharmacol. Exp. Ther.， 2012， 342（2）： 529-540

16 Hawkins M T， Lewis J H. Expert. Opin. Drug. Metab. Toxicol.， 2012， 8（12）： 1521-1530

17 Nicholson J K， Everett J R， Lindon J C. Expert. Opin. Drug. Metab. Toxicol.， 2012， 8（2）： 135-139

18 Sreekumar A， Poisson L M， Rajendiran T M， Khan A P， Cao Q， Yu J， Laxman B， Mehra R， Lonigro R J， Li Y， Nyati M K， Ahsan A， Kalyana-Sundaram S， Han B， Cao X， Byun J， Omenn G S， Ghosh D， Pennathur S， Alexander D C， Berger A， Shuster J R， Wei J T， Varambally S， Beecher C， Chinnaiyan A M. Nature， 2009， 457（7231）： 910-914

19 Nicholson J K， Connelly J， Lindon J C， Holmes E. Nat. Rev. Drug. Discov.， 2002， 1（2）： 153-161

20 Lakings D B， Waalkes T P， Borek E， Gehrke C W， Mrochek J E， Longmore J，Adamson R H. Cancer Res.， 1977， 37（1）： 285-292

21 QIN Huan-Long. Parenteral & EnteralNutrition， 2004， 11（4）： 249-252

秦環(huán)龍. 腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)， 2004， 11（4）： 249-252

22 WU Ying， ZHENG Jin-Hui， LI Jing， GAO Ru. Chinese Medical Research & Chinical.， 2005， 3（1）： 38-40

武 英， 鄭錦輝， 李 晶， 高 茹. 中國(guó)醫(yī)學(xué)研究與臨床， 2005， 3（1）： 38-40

23 JIANG Chao-Hui， LIU Xue-Lian. International Journal of Digestive Diseases.， 1992， 12（2）： 68-71

姜朝暉， 劉學(xué)廉. 國(guó)外醫(yī)學(xué)消化系疾病分冊(cè)， 1992， 12（2）： 68-71

24 FENG Xiao-Ping， JIANG Ying， HUANG Mei-Ying. Amino acid & Biotic Resources.， 1994， （1）： 17-19

馮小平， 蔣 瀅， 黃美英. 氨基酸雜志， 1994， （1）： 17-19endprint