宋璐娜 張永花 +薄紅艷 高強



摘 要 建立了基于目標DNA誘導的發卡探針DNA轉化為G-四鏈體DNA過氧化物模擬酶的非標記熒光增強型DNA檢測新體系。發卡探針DNA即分子信標探針由兩部分構成,環狀部分與目標DNA互補,莖部一端由一條富G序列構成。無目標DNA存在時,分子信標處于閉合狀態,形成發卡結構; 富G序列由于部分處于雜交狀態,無法形成G四鏈體。當目標DNA與發卡探針DNA雜交并打開發卡結構,富G序列解鏈并自發折疊成G-四鏈體結構。G-四鏈體結構與血紅素結合形成DNA模擬酶,催化H2O2還原的同時將無熒光的底物10-乙酰基-3,7-二羥基吩惡嗪(ADHP)氧化成熒光產物。通過測量熒光信號,實現對目標DNA的定量檢測。優化后的體系檢測條件為pH 8.0, 10 mmol/L K+, 0.2 μmol/L Hemin, 50 μmol/L ADHP。在優化的條件下,目標DNA在0.005~1.0 nmol/L濃度范圍內與體系熒光信號呈線性關系,檢出限為3.0 pmol/L。本方法可以區分完全互補和單堿基錯配的目標DNA。
關鍵詞 熒光; DNA; 發卡探針; G-四鏈體模擬酶; 結構轉化
1 引 言
近年來,DNA檢測在臨床診斷、基因變異識別、環境監測、食品安全以及生物學研究等領域的應用愈加廣泛,顯示出良好的應用前景,引起了研究者的廣泛關注[1]。常見的DNA檢測方法包括聚合酶鏈式反應 (PCR) 法[2]、質譜法[3]、光譜法[4]、色譜法[5]、電化學法[6]等。在光譜分析中,熒光法具有操作簡單、檢測快速、靈敏度高和選擇好等優點,是DNA定量檢測時應用最廣泛的方法之一[7]。
分子信標(Molecular beacon,MB)是一種常用的特異性檢測目標DNA或RNA的DNA探針[8]。常規的MB莖環結構的兩端通常需要標記熒光基團和淬滅基團,在無目標物存在時閉合形成發卡式的莖環結構,淬滅基團通過熒光共振能量轉移的方式淬滅發光基團發出的熒光。當目標DNA與MB的環狀區特異雜交之后,閉合的莖環發卡結構被打開,發光基團因遠離淬滅基團而發出熒光,根據熒光信號的強度來定量目標DNA。得益于發卡狀莖環結構,基于MB的DNA檢測方法通常具有較高的選擇性和靈敏度,但標記過程較為復雜耗時。此外,目標DNA和MB熒光標記分子的1∶1的比例關系也嚴重制約了基于MB方法靈敏度的提高[9]。因此,開發高靈敏度的免標記MB逐漸引起研究者的關注[10]。
近年來,DNA過氧化物模擬酶(DNAzyme)因其表現出過氧化物酶的活性,且具有穩定性好、成本低、易合成、易修飾等優點而成為傳感器信號放大研究的熱點[11~13]。DNAzyme是富含G堿基的單鏈寡核苷酸在一定條件下折疊成G-四鏈體結構,再與血紅素結合形成的復合物。利用DNAzyme的催化活性,可以實現多種物質的高靈敏度檢測,如金屬離子[14]、小分子[15]、蛋白質[16]和DNA[17]等。在大部分過氧化物模擬酶催化體系中,主要采用2,2-聯氮基雙( 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二銨鹽( ABTS) 做為酶底物,通過比色法定量[18]。雖然比色分析法簡單,但檢測實際樣品時干擾較多且靈敏度較熒光法低。因而開發基于DNAzyme催化活性的熒光檢測體系逐漸引起了研究者的興趣[19]。
本研究設計了免標記的發卡式熒光DNA分子探針,當探針與目標DNA特異性雜交后,發卡結構被打開,探針DNA的一部分會自發形成G-四鏈體,在血紅素存在時表現出過氧化物酶的活性。以無熒光的10-乙酰基-3,7-二羥基吩惡嗪(ADHP)為模擬酶底物,利用其氧化產物具有熒光的性質實現了高靈敏的DNA檢測。2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
UV-2400PC紫外可見分光光度計(日本島津工公司); F-7000 熒光儀(日本日立公司); MIR系列PCR儀(東勝創新公司)。
ADHP、30% H2O2、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、TritonX-100(Sigma-Aldrich公司); 血紅素(Hemin)、二甲基亞砜(DMSO)、醋酸鉀(Alfa Aesar公司); 實驗用水均為超純水(≥18.2 Ω·cm)。Tris-HAc(pH 8.0)緩沖液(10 mmol/L Tris,10 mmol/L HAc,0.05%(w/V)TritonX-100)。Hemin 用 DMSO 配成5 mol/L儲備液,-20℃暗處保存。ADHP 用DMSO配成20 mmol/L儲備液,冷凍保存。使用時用Tris-HAc (pH 8.0) 緩沖液稀釋到所需濃度。
2.2 實驗方法
將目標DNA樣品溶液加入DNA探針溶液中,在室溫下反應1 h,使探針發卡結構打開。加入適量Tris-HAc緩沖液( pH 8.0 )及血紅素,在室溫下反應40 min,以形成DNA過氧化物模擬酶體系。然后,將ADHP和H2O2溶液加入到溶液中,室溫反應1 h。用熒光儀測定溶液熒光,激發波長為540 nm,發射波長為581 nm。
3 結果與討論
3.1 檢測原理
免標記熒光檢測DNA的原理如圖1所示。非標記的發卡型DNA探針的莖狀部分一端是富含G堿基的序列,與分子信標另一端莖狀部分互補。
無目標序列存在時,分子信標處于閉合狀態形成發卡結構,富含G堿基的序列無法形成G-四鏈體。當加入目標DNA后,分子信標環狀部分與目標DNA進行雜交導致發卡結構被打開,從而使富含G堿基的序列游離出來,在K+和Hemin作用下形成具有過氧化物酶活性的DNA模擬酶。當加入H2O2和底物ADHP,本身不發熒光的ADHP被氧化成具有熒光的物質,通過測量體系的熒光信號達到檢測目標DNA的目的。這種免標記分子信標的優點在于不需要在DNA探針上標記熒光基團和猝滅基團,而且由于引入了過氧化物模擬酶的催化反應,放大了信號,提高了測定靈敏度。endprint
3.2 可行性驗證
首先,對檢測原理的可行性進行了驗證。如圖2所示,在沒有目標DNA 時,體系具有微弱的熒光(圖2曲線a)。由于血紅素自身具有類過氧化物酶活性,但是催化活性極低,這一微弱熒光可能來自于血紅素催化ADHP氧化為熒光產物。加入目標DNA 后,體系熒光信號明顯增強,并且熒光強度隨目標DNA的濃度的升高而增大(圖2曲線b和c),熒光信號與目標DNA濃度具有相關性。為了證明熒光信號確實來自DNA模擬酶的催化作用,考察了溶液中沒有血紅素和沒有DNA探針時體系的熒光,結果如圖2曲線d和e所示。在沒有血紅素的情況下,體系并未表現出任何熒光,表明單獨存在的G-四鏈體DNA本身并不會催化ADHP氧化。當沒有DNA探針時,體系表現出類似于沒有目標DNA時的微弱的熒光,表明目標DNA和血紅素共存物也不能有效地催化無熒光的ADHP氧化為熒光產物。以上實驗結果表明,只有在目標DNA存在下,與探針結合打開探針DNA的發卡結構,探針DNA的富G部分在K+存在下折疊成G-四鏈體DNA,然后與血紅素結合形成復合物,從而表現出明顯的過氧化物酶活性[19]。
3.3 實驗條件的優化
為了提高目標DNA檢測的靈敏度,對緩沖溶液pH值、K+濃度、血紅素的濃度以及熒光底物的濃度進行了優化,結果如圖3所示。從圖3A可見,當緩沖溶液pH值從6.5增大到9.0,體系熒光強度隨著pH值的增加先增加后減少,當pH=8.0時,熒光強度最大。這可能是由于溶液的pH值影響過氧化物模擬酶的活性。從圖3B和3C可見,模擬酶的催化活性受溶液中K+、Hemin濃度的影響,這主要是由于K+影響G-四鏈體的折疊,而Hemin是模擬酶催化活性的核心[15],二者濃度都對模擬酶的活性有較大影響。當K+濃度為10 mmol/L,Hemin濃度為0.2 μmol/L時,體系熒光強度達到最大值。從圖3D可見,隨著熒光底物ADHP的濃度的增加,熒光強度不斷增大,當ADHP濃度為50 μmol/L時,體系熒光強度達到穩定值。綜上所述,優化的檢測體系溶液組成為: pH 8.0, 10 mmol/L K+, 0.2 μmol/L Hemin, 50 μmol/L ADHP。
3.4 工作曲線和檢出限
在優化的實驗條件下,考察了體系的熒光強度和目標DNA濃度的關系。結果如圖4所示,熒光強度隨目標DNA濃度增加而增大。熒光強度和目標DNA濃度在5×10
12~1×10
9 mol/L范圍內呈良好的線性關系(圖4B),線性方程F=1.26+0.047c (pmol/L),相關系數r=0.954。依據信噪比為3(S/N=3),確定體系檢出限為 3.0 pmol/L。本方法對DNA的檢測限優于文獻[20~24],證明本方法具有很高的靈敏度。
3.5 方法的選擇性
發卡型DNA探針的最大特點在于其較高的單堿基變異區分能力。為了考察新型分子信標探針對完全互補和堿基錯配的DNA序列的區分能力,將體系用于含單堿基錯配、兩堿基錯配和非互補DNA序列的檢測,結果如圖5所示。相對于完全互補的目標DNA序列產生的熒光信號,單堿基錯配DNA只產生了弱的熒光信號, 兩堿基變異的DNA的熒光信號只有完全互補序列信號的十分之一, 非互補隨機序列的目標DNA幾乎沒有引起體系熒光強度的變化。上述結果表明, 體系具有較高的單堿基區分能力,可以區分完全互補和堿基錯配的DNA序列,具有較好的選擇性。4 結 論
建立了高靈敏度、選擇性熒光檢測DNA的體系。設計了免標記的發卡型DNA分子探針,其特點在于當DNA探針發卡結構與目標DNA結合而打開后,探針序列的一部分會自發形成G-四鏈體,在血紅素存在時表現出類過氧化物酶的活性。以無熒光的ADHP為模擬酶底物,利用其氧化產物具有熒光的性質實現了高靈敏度DNA檢測。DNA模擬酶催化反應的引入,提高了檢測的靈敏度,具有較高的靈敏度和較低的檢出限(3.0 pmol/L)。本體系具有較好的選擇性,可以區分完全互補和單堿基錯配的DNA序列。
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