Twist2、β—cadherin、E—cadherin在喉鱗狀細胞癌中的表達及其相關(guān)性分析

楊文婧　趙瑞力

[摘要] 目的 探討喉鱗狀細胞癌組織中Twist2、β-cadherin、E-cadherin的表達及其意義。 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測Twist2、β-cadherin、E-cadherin在48例喉鱗狀細胞癌組織及30例癌旁正常組織中的表達情況，分析其在不同組織中的相互關(guān)系及與喉鱗狀細胞癌臨床參數(shù)的關(guān)系。 結(jié)果 Twist2、β-cadherin、E-cadherin在喉鱗狀細胞癌及癌旁正常組織中的陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；喉鱗狀細胞癌中Twist2、β-cadherin及E-cadherin的陽性表達率在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；在不同臨床分型及年齡間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；喉鱗狀細胞癌中Twist2的陽性表達與β-cadherin的陽性表達呈負(fù)相關(guān)（r=-0.434，P=0.005），與E-cadherin的陽性表達亦呈負(fù)相關(guān)（r=-0.344，P=0.034）。 結(jié)論 Twist2與β-cadherin、E-cadherin在喉鱗狀細胞癌發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，Twist2與β-cadherin、E-cadherin的協(xié)同作用可能影響喉鱗狀細胞癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 喉鱗狀細胞癌；Twist2；β-cadherin；E-cadherin；免疫組化

[中圖分類號] R739.65 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）08（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significances of Twist2，β-cadherin and E-cadherin in LSCC. Methods The expression of Twist2，β-cadherin and E-cadherin were detected by immunohistochemistry S-P method in 48 tissue LSCC and 30 tumor-adjacent normal tissue.The relationship between three factors and clinical pathological features of LSCC were investigated. Results The differences of the positive rates of Twist2，β-cadherin and E-cadherin in LSCC and tumor-adjacent normal were statistically significant （P<0.01）；the positive expression rates of Twist2，β-cadherin and E-cadherin in lympha node metastasis，clinical stage in LSCC were statistically significant （P<0.05 or P<0.01）；no statistically significant difference between the different clinical type and age groups（P>0.05）.The positive expression of Twist2 was negatively related to that of β-cadherin （r=-0.434，P=0.005），and also negatively related to that of E-cadherin （r=-0.344，P=0.034）. Conclusion Twist2，β-cadherin and E-cadherin play important role in the occurrence，infiltration and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma.The synergistic effect of Twist2，β-cadherin and E-cadherin may have some effects on the infiltration and metastasis of laryngeal carcinoma.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma；Twist2；β-cadherin；E-cadherin；Immunohistochemistry

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多步驟的過程。同其他惡性腫瘤一樣，喉鱗狀細胞癌的發(fā)生也是多基因、多因素、多條途徑共同參與的復(fù)雜過程，抑癌基因失活與癌基因的激活并存，最終導(dǎo)致了正常細胞生長和分化失去控制，所以，目前從基因水平上了解喉鱗狀細胞癌得到人們的高度重視。Twist2是堿性Helix-loop-helix（b-HLH）蛋白家族中的重要一員，近年來開始被關(guān)注。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Twist2與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生及腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。但在與喉鱗狀細胞癌的相關(guān)性研究還尚未見報道。本實驗采用免疫組化S-P法檢測喉鱗狀細胞癌及癌旁正常組織中的Twist2、β-cadherin及E-cadherin蛋白的表達情況，探討其在喉鱗癌的發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移中的作用及三者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集48例喉鱗狀細胞癌組織及癌旁正常組織30例，均來自于滄州市人民醫(yī)院耳鼻喉科2010年2月～2013年5月的喉鱗狀細胞癌手術(shù)切除標(biāo)本和手術(shù)切除的距安全切緣1 cm以上的癌旁正常組織，并均經(jīng)過病理檢查確定。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。所有喉癌患者術(shù)前都未行放、化療，臨床資料完整。喉癌狀細胞患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，無淋巴轉(zhuǎn)移者24例；高分化（G1級）13例，中分化（G2級）19例，低分化（G3級）16例；Ⅰ+Ⅱ期患者18例，Ⅲ+Ⅳ期患者30例；聲門上型17例，聲門型31例。年齡41～80歲，中位年齡60.2歲。

1.2 主要試劑

Twist2鼠單克隆抗體（Twist2 C1a：sc-81417，Santa Cruz Biotechnology Inc）；β-cadherin、E-cadherin鼠單克隆抗體（ZM-0094，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）；鼠二抗免疫組化試劑盒（SP-9002，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色液（ZLI-9032，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

所選標(biāo)本均制成石蠟標(biāo)本，4 μm連續(xù)切片，一抗所選濃度Twist2、β-cadherin鼠單克隆抗體1∶100；E-cadherin鼠抗人單克隆抗體1∶50。采用免疫組織化學(xué)S-P法，嚴(yán)格遵守操作步驟進行實驗。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對照，作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，癌旁正常組織為正常對照組。

1.4 結(jié)果判定

Twist2在細胞質(zhì)中陽性著色，陽性著色細胞會出現(xiàn)片狀或顆粒狀的胞質(zhì)。結(jié)果采用半定量記分法判定[1]，按陽性著色程度、陽性細胞所占比例分別評分，再用兩者的乘積來判定結(jié)果：<4分為陰性表達，4～12分為陽性表達。

β-cadherin、E-cadherin在細胞膜上陽性著色，陽性細胞會出現(xiàn)呈棕黃色顆粒狀或線狀均勻完整的胞膜著色。判定結(jié)果參考Fromowitz評分標(biāo)準(zhǔn)[2]，選取5個高倍視野（×400）得出陽性細胞百分率；再根據(jù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色強度予以記分，最后將兩項得分相加：<3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)均經(jīng)Excel整理后采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Twist2在喉鱗狀細胞癌及癌旁組織中的表達

Twist2在喉鱗狀細胞癌中陽性表達率為58.33%（28/48），高于癌旁正常組織中陽性表達率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（16.67%，5/30）（P<0.01）（表1）。在喉鱗狀細胞癌中，Twist2在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組（N+）的陽性表達率（83.3%）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組（N0）的陽性表達率（33.3%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)TNM分期，喉鱗狀細胞癌Ⅰ+Ⅱ期病例組的陽性表達率（22.2%）明顯低于Ⅲ+Ⅳ期病例組（80.0%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而與腫瘤病理學(xué)分級、臨床分型及年齡分組無關(guān)（P>0.05）（表2）。

β-cadherin在喉鱗狀細胞癌中陽性表達率為35.42%（17/48），低于癌旁正常組織中陽性表達率（100.00%，30/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表1）。在喉鱗狀細胞癌中，β-cadherin在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組（N+）的陽性表達率（16.7%）明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組（N0）的陽性表達率（54.2%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)TNM分期，喉鱗狀細胞癌Ⅰ+Ⅱ期病例組的陽性表達率（55.6%）明顯高于Ⅲ+Ⅳ期病例組（23.3%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而與腫瘤病理學(xué)分級、臨床分型及年齡分組無關(guān)（P>0.05）（表2）。

E-cadherin在喉鱗狀細胞癌中陽性表達率為22.92%（11/48），低于癌旁正常組織中陽性表達率（100.00%，30/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表1）。在喉鱗狀細胞癌中E-cadherin的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N+組低于N0組，P<0.01）、臨床分期（Ⅰ+Ⅱ期高于Ⅲ+Ⅳ期，P<0.01）和病理分級（G2+G3級低于G1級，P<0.01）相關(guān)，而與臨床分型及年齡分組無關(guān)（P>0.05）（表2）。Twist2、β-cadherin和E-cadherin在喉鱗狀細胞癌及癌旁正常組織中的表達見圖1～圖3。

2.2 Twist2與β-cadherin、E-cadherin在喉鱗狀細胞癌中的相關(guān)性

在48例喉癌中，Twist2、β-cadherin在5例喉鱗狀細胞癌組織中均呈陽性表達，Twist2、β-cadherin在8例喉鱗狀細胞癌中均呈陰性表達，Twist2表達陽性但β-cadherin表達陰性的喉鱗狀細胞癌有23例，β-cadherin表達陽性但Twist2表達陰性的喉鱗狀細胞癌有12例。Spearman相關(guān)分析顯示，Twist2與β-cadherin呈負(fù)相關(guān)表達（r=-0.434，P=0.005）。

在48例喉鱗狀細胞癌中，Twist2、E-cadherin在3例喉鱗狀細胞癌組織中均呈陽性表達，Twist2、E-cadherin在12例喉鱗狀細胞癌中均呈陰性表達，Twist2表達陽性但E-cadherin表達陰性的喉鱗狀細胞癌組織有25例，E-cadherin表達陽性但Twist2表達陰性的喉鱗癌組織有8例。Spearman相關(guān)分析顯示，Twist2與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)表達（r=-0.344，P=0.034）。

3 討論

在胚胎的發(fā)育過程中，上皮細胞之所以會逃避組織結(jié)構(gòu)所造成的空間限制，是因為它會轉(zhuǎn)變成另一種更加合適的細胞移動表型——間充質(zhì)表型，這個過程即為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)型（EMT）。目前研究發(fā)現(xiàn)，EMT可以使不具有轉(zhuǎn)移潛力和侵襲性的非惡性腫瘤細胞獲取侵襲的能力，轉(zhuǎn)移至其他器官。EMT被基質(zhì)細胞外信號啟動，這包括細胞外基質(zhì)的組成成分和生長因子，EMT被EMT轉(zhuǎn)錄因子的激活物調(diào)節(jié)，如Twist1、Snail、Slug、ZEB1、ZEB2[3-6]。國外研究表明，Twist2與Twist1類似，可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Twist2在卵巢癌中表達上調(diào)，很可能通過促進EMT轉(zhuǎn)變，從而使間葉細胞標(biāo)志物Vimentin、fibronectin表達增多，繼而增加侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[8]。Twist2與甲狀腺癌、乳腺癌的表達在國內(nèi)外有相關(guān)報道[9-17]，但其在喉鱗狀細胞癌中的表達尚未研究。本實驗顯示，Twist2在喉鱗癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織中的陽性表達率（P<0.01）。在喉鱗癌組織中Twist2陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM臨床分期相關(guān)（P<0.05），但在臨床分型、腫瘤病理學(xué)分級及年齡分組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。此結(jié)果與毛宇彬等[8]報道的卵巢癌中Twist2的基因表達結(jié)果相一致。由此推斷Twist2高表達的鱗狀細胞癌組織具有更強的侵襲能力，Twist2可能成為判斷喉鱗狀細胞癌預(yù)防或預(yù)后的檢測指標(biāo)之一。

β-cadherin的羧基末端與E-cadherin胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，氨基末端與α-cadherin連接可形成E-cadherin/cadherin復(fù)合體從而穩(wěn)定E-cadherin結(jié)構(gòu)，促進細胞間的黏附連接。本實驗發(fā)現(xiàn)，喉鱗狀細胞癌中β-cadherin陽性表達明顯低于癌旁正常組織，提示喉鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移、侵襲能力越高，β-cadherin的陽性表達率越低。焦陽等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌中β-cadherin高表達，并且與臨床分期、門靜脈栓、肝外轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，與本實驗結(jié)果相吻合。本實驗結(jié)果表明，喉鱗狀細胞癌中E-cadherin陽性表達明顯低于癌旁正常組織，提示喉鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移、侵襲能力越高，E-cadherin的陽性表達率越低。Rodrigo等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在聲門上型喉癌組織中E-cadherin表達下調(diào)與喉癌患者的臨床參數(shù)，如頸巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、組織學(xué)分化程度及腫瘤復(fù)發(fā)均呈負(fù)相關(guān)，提示檢測喉癌患者的E-cadherin的表達對于評估病情及制訂臨床治療方案有重要意義。

EMT過程中，上皮細胞經(jīng)歷了重要的表型轉(zhuǎn)變，E-cadherin和其他上皮細胞功能的組成結(jié)構(gòu)表達的缺失及侵襲特性使它們轉(zhuǎn)移至細胞外基質(zhì)[20]。Twist2形成Twist1/Twist2/Mi2/NuRD蛋白復(fù)合物，其與E-box的啟動子結(jié)合，下調(diào)E-cadherin的表達，導(dǎo)致EMT的發(fā)生[19]。β-catenin與E-cadherin鏈接形成復(fù)合體，對細胞間質(zhì)起到穩(wěn)固作用[21]，當(dāng)β-catenin表達異?；蚬δ軉适r，與E-cadherin的鏈接就會喪失，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和侵襲[22]。本實驗對Twist2、β-cadherin和E-cadherin三者的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Twist2與E-cadherin及β-cadherin均呈負(fù)相關(guān)。Twist2參與喉鱗狀細胞癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及浸潤可能通過上調(diào)E-cadherin同時下調(diào)β-cadherin介導(dǎo)發(fā)生EMT。聯(lián)合檢測喉鱗狀細胞癌組織中Twist2、β-cadherin和E-cadherin的表達情況對患者的診療與預(yù)后具有指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2015-06-11 本文編輯：衛(wèi) 軻）