注射用炎琥寧細菌內毒素檢查方法的可行性研究

王愛紅

[摘要] 目的 研究注射用炎琥寧對細菌內毒素檢查試驗的干擾情況，建立其細菌內毒素限量及檢查方法。 方法 按《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ E進行實驗，采用細菌內毒素凝膠法，用2個廠家的鱟試劑對3批注射用炎琥寧進行干擾試驗和結果的判斷。 結果 注射用炎琥寧最大不干擾濃度為0.33 mg/ml，即需要稀釋240倍對測定不產生干擾。 結論 注射用炎琥寧細菌內毒素限值確定為0.75 EU/mg，可采用凝膠法應用鱟試劑進行細菌內毒素檢查。

[關鍵詞] 注射用炎琥寧；細菌內毒素；凝膠法；鱟試劑；干擾試驗

[中圖分類號] R286.0 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）08（c）-0095-03

[Abstract] Objective To study the interference to bacterial endotoxin test from Potassium Sodium Pehydroandrographolide Succinate for Injection，and estsblish a method of the limits and detection of bacterial endotoxin. Methods The experiment was performed according to Appendix Ⅺ E of Chinese Pharmacopeia （2010 edition，2 volume），interference experiment and result analysis were made in three batch samples of Potassium Sodium Pehydroandrographolide Succinate for Injection，in which bacterial endotoxin method of gelation assay was used by tachypleus amebocyte lysate （TAL） from two different manufacturers. Results The maximum noninterference concentration of Potassium Sodium Pehydroandrographolide Succinate for Injection was 0.33 mg/ml，which meaned the inhibition effect could be eliminated by diluting to 240 times. Conclusion The bacterial endotoxin test can be used to detect the endotoxins in Potassium Sodium Pehydroandrographolide Succinate for Injection and the bacterial endotoxin limit is 0.75 EU/mg.

[Key words] Potassium Sodium Pehydroandrographolide Succinate for Injection；Bacterial endotoxin；Gelation assay；Tachypleus amebocyte lysate；Interference test

注射用炎琥寧是由穿心蓮內酯半酯單鉀鹽和適量的輔料組成的凍干制劑，具有促進發熱的消退、增加機體對病原體感染的能力，有明顯的鎮靜作用，臨床常用于治療病毒性肺炎和病毒性上呼吸道感染。

注射用炎琥寧的使用說明書根據國家食品藥品監督管理局審核批準執行，靜脈滴注，0.16～0.4 g/d，用0.5%葡萄糖氯化鈉注射液稀釋后滴注，其質量標準WS-B-10001-（HD-0016）-2002項下的熱原檢查法為家兔法。此法操作繁瑣，不利于快速檢測，因此本文依據《中國藥典》2010年版二部Ⅺ E“細菌內毒素檢查法”，利用鱟試劑對其凍干注射劑的細菌內毒素檢查進行可行性的方法學研究，并給出細菌內毒素限值，為實驗室對其質量進行快速并準確的檢查提供依據。

1儀器與試藥

1.1 儀器

數顯式電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫療器械公司，型號：HH·W21·420S）；漩渦混合器（上海環球物化儀器廠，型號：WH-861）。實驗所用的相關器皿均經250℃干燥1 h，以達到無外源性內毒素。

1.2 試藥

注射用炎琥寧（安徽宏業藥業有限公司，批號：150302、150304、150306、150308、150310、150312，規格：80 mg）。鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1408300，規格：0.25 EU/ml，0.1 ml/支；福建新北生化有限公司，批號：14080912，規格：0.25 EU/ml，0.1 ml/支）。細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201478，規格：80 EU/支）。細菌內毒素檢查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1405130，規格：5 ml/支）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度的復核

為考察鱟試劑靈敏度的標示值（λ）是否準確、人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規定，按《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查法試驗，對本實驗所用2個廠家的鱟試劑進行靈敏度復核，要求所用的靈敏度在0.5λ～2.0λ之間。結果表明，上述2個廠家的鱟試劑均在靈敏度范圍內，復核合格（表1），可以用于干擾試驗和供試品的細菌內毒素檢查。

2.2 細菌內毒素限值L的確定

根據細菌內毒素限值的計算公式：L=K/M，其中L為供試品細菌內毒素的限值，本品以EU/mg表示。K為按規定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內毒素的量，以EU/（kg·h）表示，其中注射劑，K=5 EU/（kg·h）；M為每公斤每小時最大的藥物劑量，以mg/（kg·h）表示，人均體重按60 kg計算。本品成人通常1～2次/d，靜脈滴注160～400 mg，可根據年齡、癥狀適量增減，用藥劑量限度為400 mg/d。按臨床劑量1次400 mg炎琥寧計算，L=K/M=5 EU/（kg·h）/[400 mg/60（kg·h）]=0.75 EU/mg。

2.3供試品干擾試驗預試驗

應用上述2個廠家的鱟試劑，初步確定注射用炎琥寧的最大不干擾濃度。根據供試品L為0.75 EU/mg，取本品1瓶，加細菌內毒素檢查用水5 ml使溶解，分別再用細菌內毒素檢查用水稀釋成20、120、240、480倍系列濃度的溶液，將20、120、240、480倍的系列溶液標記為供試品陰性對照（NPC）；同時在20、120、240、480倍的系列溶液中加入等體積細菌內毒素工作標準品，制成2.0λ的內毒素標準溶液標記為供試品陽性對照（PPC）；每個濃度平行做2支。另取2支鱟試劑加入2.0λ的內毒素標準溶液作為陽性對照（PC）；2支加入檢查用水作為陰性對照（NC）。當出現NPC為陰性，PPC為陽性時，則供試品在該稀釋倍數下不干擾實驗。結果表明，注射用炎琥寧對細菌內毒素檢查有干擾，但可以通過稀釋消除。初步確定注射用炎琥寧的最大不干擾濃度為0.33 mg/ml，即需稀釋240倍以上，可在此濃度下進行正式的干擾試驗（表2）。

2.4 供試品干擾試驗

根據預實驗的結果，在進行正式干擾試驗時選擇供試品最大不干擾濃度為0.33 mg/ml。取3批注射用炎琥寧，使用上述2個廠家靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑，分別用稀釋成0.33 mg/ml的供試品溶液將細菌內毒素工作標準品稀釋成0.5、0.25、0.125、0.0625 EU/ml的系列細菌內毒素溶液，檢測供試品在此濃度下是否對細菌內毒素檢查存在干擾。每一濃度平行做4支，同時用供試品溶液作為2支NC，（37±1）℃下保溫60 min后觀察結果。經用2個廠家生產的鱟試劑進行正式干擾試驗，結果Es在0.5λ～2.0λ范圍內，Et在0.5 Es～2.0 Es的范圍內，說明供試品在進行240倍稀釋后已排除干擾作用，在此濃度下可以對注射用炎琥寧進行細菌內毒素檢查（表3、表4）。

2.5供試品的細菌內毒素檢查

取注射用炎琥寧6批，按《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE依法檢查，按炎琥寧計算，每毫克炎琥寧中含內毒素的量應小于0.75 EU。在檢查中，每批供試品做2支供試管NPC和2支供試管PPC，同時做2支PC和2支NC。結果表明，供試管和陰性管均為陰性，陽性管和供試品陽性管均為陽性，說明3批樣品的細菌內毒素含量均小于0.75 EU/mg，符合規定（表5）。

3 討論

細菌內毒素是革蘭氏陰性桿菌生長或死亡時裂解出來的菌膜脂多糖成分。作為非腸道藥物的質量控制，家兔法是傳統的檢查法。因兔試驗法影響因素多，不能標準化。采用細菌內毒素法控制注射劑的產品質量是藥品檢驗的發展趨勢。本試驗對采用細菌內毒素檢查法控制注射用炎琥寧質量進行了可行性研究。在試驗前，研究炎琥寧生產工藝的應用，筆者首先考察了原料溶媒注射用水和13個批次注射用炎琥寧中間體的熱原（細菌內毒素）污染情況，結果表明注射用水和中間體的細菌內毒素均不超標，為注射用炎琥寧采用鱟試劑法控制其內毒素提供了研究基礎。

注射用炎琥寧對不同廠家的鱟試劑可能存在不同的干擾程度，因此在干擾預試驗中使用了2個廠家的鱟試劑進行凝膠法內毒素檢查，結果表明2個廠家的鱟試劑檢驗結果一致，因此確定注射用炎琥寧的最大不干擾濃度為0.33 mg/ml，即稀釋240倍。

正式的干擾試驗用了2個廠家的鱟試劑（靈敏度為0.25 EU/ml），對3批經稀釋240倍的注射用炎琥寧分別進行細菌內毒素的干擾試驗，結果顯示Es均在0.5λ～2.0λ范圍，供試品均在0.5Es～2.0Es的范圍，確認在此濃度下本品細菌內毒素與鱟試劑的反應試驗無干擾作用。

在細菌內毒素限值確定為0.75 EU/mg的情況下，用2個廠家靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑按凝膠法分別對6個批次供試品進行內毒素檢查，結果均符合規定，表明注射用炎琥寧可采用鱟試劑進行細菌內毒素檢查。

另外，注射用炎琥寧的細菌內毒素檢查方法如下：取本品，依法檢查（《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ E），按炎琥寧計算，每毫克炎琥寧中含內毒素的量應小于0.75 EU。根據此法建立的細菌內毒素檢查法是可行的，且方便快速，結果準確可靠。

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（收稿日期：2015-03-31 本文編輯：衛 軻）